Nat Immunol?|?“雙面人生”——揭示TOX的CD4+ T細胞譜系特異性功能

撰文 |咸姐

T細胞的分化與功能受轉錄因子的精密調控，其命運取決于抗原遭遇的性質和微環境信號。具體而言，初始CD8+ T細胞在急性感染等免疫激活條件下，可分化為具有細胞毒功能的效應細胞并形成長壽命記憶細胞；而在腫瘤或慢性感染等持續性抗原刺激下，則會進入一種低反應性的"耗竭"狀態。相比之下，CD4+ T細胞的分化更為多樣，在不同細胞因子環境的驅動下，初始CD4+ T細胞可極化為多種輔助T細胞亞群，包括TH1、TH2、TH17、濾泡輔助T細胞（TFH）和調節性T細胞（Treg）。每個亞群的譜系定型均由特定的"主轉錄因子"及其調控的效應細胞因子所定義【1,2】。 其中一種對T細胞發育和分化至關重要的特定核轉錄因子是TOX，其屬于TOX家族（包括TOX、TOX2、TOX3和TOX4）的重要成員。該蛋白最初在胸腺細胞發育中被發現，是CD4+胸腺細胞發育、自然殺傷細胞（NK細胞）分化以及固有淋巴細胞（ILC）從共同淋巴祖細胞分化所必需的關鍵調控因子。在胸腺發育過程中，TOX作為上游調控因子激活ThPOK的表達，從而決定CD4+T細胞譜系的定向分化【3】。目前， TOX在CD8+ T細胞生物學中的功能已被廣泛研究，在腫瘤和慢性感染等持續性抗原刺激條件下，CD8+ T細胞中的TOX高表達，并通過上調抑制性受體來介導T細胞耗竭和維持其存活【4】。然而， TOX在CD4+ T細胞中的表達模式、調控機制及其功能意義仍然不甚明確。

近日，來自美國斯隆·凱特林研究所的Andrea Schietinger團隊在Nature Immunology上在線發表題為TOX drives CD4+ TH1 effector function, antitumor immunity and autoimmune pathology的文章，系統研究了TOX在外周CD4+ T細胞分化及輔助T細胞命運定型中的作用，發現TOX在小鼠和人類的TH1細胞譜系中均高表達，且是TH1細胞效應功能所必需的，尤其是對于IFNγ的產生至關重要，并且與增強的抗腫瘤免疫、對免疫療法的響應以及自身免疫性疾病和炎癥性疾病中的致病性反應密切關聯。研究結果為理解CD4+ T細胞的譜系特異性調控機制提供了新的視角，也為優化基于T細胞的免疫治療策略提供了理論基礎。

為了探究TOX在CD4+ T細胞分化中的作用，研究者通過體外極化實驗發現，在小鼠和人類的多種輔助T細胞亞群中，TOX均在TH1細胞中表達水平最高。在PR8流感病毒感染的小鼠模型中，病毒特異性TH1細胞同樣高表達TOX，且產生IFNγ的效應TH1細胞亞群中TOX表達尤為顯著。進一步的動力學分析顯示，TOX在TH1極化后48小時開始表達，早于IFNγ的產生。同時，研究表明，TOX的誘導依賴于TCR信號（需NF-κB、AP1和NFAT協同激活）以及CD28共刺激信號，而IL-12信號雖非TOX誘導所必需，卻是IFNγ產生的關鍵。使用FK506抑制NFAT信號可完全阻斷TOX表達和IFNγ產生，證實TOX位于TCR-NFAT信號軸下游。此外，在淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒（LCMV）慢性感染和B16-GP61腫瘤模型中，經歷持續抗原刺激的抗原特異性CD4+ T細胞同樣高表達TOX并維持IFNγ產生，表明在體內慢性炎癥和腫瘤微環境中，TOX高表達是TH1細胞的標志性特征并與效應功能密切相關。

為了了解TOX是否對TH1細胞效應器功能起關鍵作用，研究人員隨后進行了功能獲得和功能缺失實驗。實驗結果顯示，過表達TOX使得 CD4+ T細胞中IFNγ產生顯著增加，而TNF、IL-17A和IL-4等其他譜系細胞因子未受影響，且pSTAT1、pSTAT4和T-bet表達水平無變化，提示TOX可以特異性增強TH1細胞效應功能。此外，通過dLck-Cre系統在TCR轉基因SMARTA（TCR SMARTA ）小鼠模型（該小鼠的CD4+ T細胞經過基因工程改造，使其TCR能夠特異性識別LCMV的GP61-80表位）中特異性敲除Tox基因，將初始TOX敲除或野生型TCR SMARTA CD4+ T細胞過繼轉移至B16-GP61荷瘤小鼠體內，發現TOX敲除不影響CD4+ T細胞的激活和增殖，但導致抑制性受體PD-1和LAG3表達下降，更重要的是IFNγ產生能力嚴重受損，而TNF產生保留。同時，TOX敲除后T-bet表達未受影響，但EOMES、pSTAT1和pSTAT4水平顯著降低，且晚期CD4+ T細胞顯著減少，提示TOX可能通過STAT信號通路調控TH1細胞效應功能和存活。利用CRISPR-Cas9技術在原代初始CD4+ T細胞中急性敲除Tox并過繼轉移至荷瘤小鼠，同樣證實TOX缺失導致IFNγ產生能力喪失。總之，這些數據揭示了TOX選擇性地調節外周CD4+ T細胞中TH1細胞因子IFNγ的產生。

為深入揭示TOX在CD4+ T細胞中驅動TH1效應功能的分子機制， 研究人員 對過繼轉移至B16-GP61荷瘤小鼠第11天的野生型與TOX敲除TCR SMARTA 細胞進行了多組學分析。轉錄組分析結果顯示，TOX敲除后TH1相關轉錄因子Stat1、Stat4、Nfatc2、Ets1和效應分子Ifng表達下調，而TCR信號負調控因子Nfkbid等表達上調。ATAC-seq發現，TOX敲除導致Ifng位點附近的關鍵調控區域——包括遠端增強子CNS-34和長鏈非編碼RNA Tmevpg1基因座——染色質可及性喪失，且這些區域高度富集ETS和NF-κB家族轉錄因子結合基序。為進一步明確TOX的直接靶點，研究人員對來自B16-GP61荷瘤小鼠的表達TOX的CD4+ TCR SMARTA 細胞進行了CUT&RUN分析，發現TOX直接結合于多個IFNγ正向調控基因位點，包括Tmevpg1、Stat4、Stat1、Nfkb1、Nfatc2和Ets1。研究人員還發現。TOX敲除后NF-κB1蛋白水平降低，而NF-κB激動劑可部分恢復IFNγ產生。以上結果表明，TOX通過直接結合并調控多個關鍵轉錄調控因子基因位點，協同維持TH1細胞效應分子的染色質可及性和轉錄活性，從而驅動CD4+ T細胞的TH1效應功能。

以上 數據表明，TOX在CD4+和CD8+ T細胞中可能發揮相反的功能，為此，研究人員比較了兩種細胞中TOX調控的轉錄程序。RNA-seq分析顯示，僅139個差異表達基因在兩個譜系中重疊，包括共同下調的抑制性受體（Tigit、Pdcd1）和共同上調的TCR信號負調控因子（Nfkbid、Egr2），表明TOX在兩個譜系中共同發揮驅動激活和增強TCR信號的核心功能。然而，TOX在CD4+ T細胞中特異性調控TH1細胞因子程序，表現為ETS和NF-κB家族轉錄因子表達及下游活性顯著降低，而CD8+敲除細胞中則表現為E2F家族和Hic1的活性差異。為進一步解析TOX在兩種細胞中功能差異的機制，研究人員對腫瘤來源的TOX陽性CD4+和CD8+ T細胞進行了CUT&RUN分析。結果顯示，TOX在兩種細胞系中共同結合于干細胞相關基因位點，提示TOX在TCR信號下游被誘導后通過抑制干細胞相關基因表達，使T細胞退出初始/干細胞樣狀態。而在CD4+ T細胞中，TOX特異性結合于Nfatc2及NF-κB信號驅動因子和ETS靶基因等基因位點。這些發現表明TOX通過NFAT、NF-κB、ETS轉錄因子和STAT信號的協同作用，特異性調控CD4+ T細胞中TH1細胞的IFNγ產生。

最后， 鑒于TOX在人類腫瘤中被定義為CD8+ T細胞耗竭的主轉錄因子并與免疫治療抵抗相關，研究人員探究了TOX在人類CD4+ T細胞中是否與增強的抗腫瘤免疫相關。通過對接受免疫治療的肝細胞癌和膀胱癌患者單細胞RNA-seq數據分析發現，臨床應答者中CXCL13+ CD4+ T細胞群富集TOX和IFNG表達，且TOX與IFNG呈正相關，提示TOX+ CD4+ T細胞標記了一群產生IFNγ的細胞毒性CD4+ T細胞亞群，與免疫治療的良好響應相關。在自身免疫性血管炎患者單細胞數據中，致病性細胞毒性CD4+ T細胞亞群同樣高表達TOX和IFNG，且該亞群對CD4 TOX特征的富集程度高于CD8 TOX特征。研究人員還在自身免疫性糖尿病NOD小鼠模型中驗證，胰腺中針對雜交胰島素肽的致病性CD4+ T細胞也高表達TOX并產生IFNγ和TNF。這些結果表明，TOX+ CD4+ T細胞不僅在人類腫瘤中與抗腫瘤免疫和免疫治療響應相關，也在自身免疫和炎癥性疾病中與致病性反應相關聯。

綜上所述， 本研究揭示了TOX在CD4+ T細胞中的全新關鍵作用——作為TH1細胞分化的核心驅動因子，通過直接調控Stat1、Stat4、Nfkb1及Tmevpg1等基因，維持Ifng位點染色質可及性，從而促進IFNγ產生。與CD8+ T細胞中TOX介導耗竭不同，CD4+ T細胞中TOX驅動效應功能并與抗腫瘤免疫及免疫治療響應正相關，但也參與自身免疫疾病的致病過程。這一發現重新定義了TOX的生物學功能，為靶向CD4+ T細胞的免疫治療策略提供了新思路。

https://doi.org/10.1038/s41590-026-02453-2

制版人： 十一

參考文獻

1. Kaech, S. M. & Cui, W. Transcriptional control of effector and memory CD8+ T cell differentiation.Nat. Rev. Immunol.12, 749–761 (2012).

2. Zhou, L., Chong, M. M. & Littman, D. R. Plasticity of CD4+ T cell lineage differentiation.Immunity30, 646–655 (2009).

3. Aliahmad, P., Seksenyan, A. & Kaye, J. The many roles of TOX in the immune system.Curr. Opin. Immunol.24, 173–177 (2012).

4. Scott, A. C. et al. TOX is a critical regulator of tumour-specific T cell differentiation.Nature571, 270–274 (2019).

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