抗體親和力/親合力概念、改造策略、不同檢測方法特點及與PK/PD的關(guān)系

單抗源于體液免疫的生物學(xué)機(jī)制，已成為診斷和治療多種疾病的多樣化、快速增長的療法。2022年超250種抗體進(jìn)入臨床研究，2024年全球銷售額前10的藥物中至少一半為抗體。抗體藥物研發(fā)的一個核心挑戰(zhàn)是，早期開發(fā)階段需深度表征抗體的生物學(xué)特性，如親和力，以選擇最適合臨床需求的候選抗體。

抗體由2個Fab（抗原結(jié)合域）和1個Fc（可結(jié)晶片段）組成。Fab含互補(bǔ)決定區(qū)（CDRs），通過非共價結(jié)合識別抗原。Fc結(jié)合Fc受體（FcγRs），觸發(fā)免疫效應(yīng)（如ADCC/ADCP）。此外，還有一些新型設(shè)計，如雙抗、ADC、免疫細(xì)胞因子融合物等。不同IgG亞型對FcγR的親和力不同，影響效應(yīng)功能。可通過一些策略進(jìn)行改造，比如糖工程（如去巖藻糖基化）增強(qiáng)ADCC；序列或鉸鏈區(qū)工程調(diào)節(jié)Fc柔性或取向；通過抗原結(jié)合引發(fā)的變構(gòu)效應(yīng)，間接調(diào)控Fc受體結(jié)合。另外，靶點類型也具備一定的多樣性，既有可溶性抗原（細(xì)胞因子、激素），也有膜蛋白（受體、信號分子）。抗體可以通過阻斷配體-受體復(fù)合物發(fā)揮作用，也可以通過FcγR激活效應(yīng)細(xì)胞（如NK細(xì)胞）清除靶細(xì)胞，又可模擬多價配體誘導(dǎo)受體聚集（如激活免疫信號）。抗體親和力并非越高越好，需綜合評估親和力與功能的關(guān)系。本文圍繞抗體親和力這一話題展開討論。

親和力（Affinity）和親合力（Avidity）

首先需要區(qū)分一個概念親和力（Affinity）和親合力（Avidity）。

親和力（Affinity）指抗體與抗原的“結(jié)合強(qiáng)度”，反映抗體與抗原之間的結(jié)合緊密程度，由結(jié)合速率（kon）與解離速率（koff）共同決定，單位為平衡解離常數(shù)（KD=koff/kon）。主要描述CDR與抗原表位之間的相互作用，作用強(qiáng)度依賴非共價作用力，如氫鍵、范德華力、靜電作用等。

親合力（Avidity）指抗體雙價結(jié)合帶來的“整體親和力”，由于天然抗體為雙價結(jié)構(gòu)，可同時結(jié)合兩個抗原，這種協(xié)同效應(yīng)稱為親合力（Avidity），可表現(xiàn)為表觀親和力增強(qiáng)。抗體兩個Fab臂結(jié)合鄰近表位（如細(xì)胞膜上重復(fù)抗原），需同時解離才能釋放抗體，顯著延長解離半衰期。對于膜抗原，抗體與細(xì)胞表面抗原結(jié)合后，局部抗體有效濃度升高，第二結(jié)合事件更易發(fā)生，依賴于細(xì)胞密度與抗原表達(dá)水平。

下表總結(jié)了兩個概念的區(qū)別。

調(diào)節(jié)抗體-抗原結(jié)合的策略

序列改造調(diào)節(jié)抗體親和力

可以利用體外篩選與人工親和力成熟技術(shù)平臺，如噬菌體/酵母/哺乳動物展示系統(tǒng)實現(xiàn)。大致流程是，先構(gòu)建天然抗體文庫，后通過PCR隨機(jī)突變或定點突變生成突變庫，再通過多輪篩選逐步提升親和力。該技術(shù)的優(yōu)勢是無動物實驗倫理問題，且可精確控制親和力范圍。

也可以利用體內(nèi)親和力成熟技術(shù)路徑，如免疫動物（如表達(dá)人源抗體基因的轉(zhuǎn)基因小鼠）后，從記憶B細(xì)胞/漿細(xì)胞中篩選高親和力抗體。該技術(shù)的優(yōu)勢是可生成天然構(gòu)象、高親和力且臨床轉(zhuǎn)化潛力高的抗體。缺點是親和力調(diào)控精度低于體外方法。

隨著技術(shù)的發(fā)展，下一代測序（NGS）與AI/ML的協(xié)同應(yīng)用在抗體親和力改造方面也有一定價值，并可能是未來發(fā)展的重要方向之一。NGS可大規(guī)模獲取抗體編碼核酸序列，若已有大量抗體序列及其結(jié)合數(shù)據(jù)，進(jìn)行AI模型訓(xùn)練，AI/ML可用于預(yù)測高親和力序列，設(shè)計突變位點以優(yōu)化親和力，或從頭設(shè)計抗體（denovo design），僅基于靶點信息構(gòu)建高親和力抗體。目前已經(jīng)有一些數(shù)據(jù)庫和資源支持以上操作，如序列數(shù)據(jù)庫OAS（Observed Antibody Space）和PLAb Dab（Patent and Literature Antibody Database）；結(jié)構(gòu)/親和力數(shù)據(jù)庫SKEMPI、CATH、HER2結(jié)合數(shù)據(jù)集等。不過，截至目前，尚未有經(jīng)AI/ML設(shè)計的抗體進(jìn)入臨床。

通過結(jié)構(gòu)工程提升抗體靶點結(jié)合效率

除通過改造序列，“提高親和力”外，還可通過改造抗體結(jié)構(gòu)（如雙特異、多特異、附加功能域）來增強(qiáng)結(jié)合效率。

雙特異性抗體（bsAbs）指一條抗體分子含兩個不同F(xiàn)ab，可同時識別兩個抗原或一個抗原上的兩個表位。作用模式分為cis和trans兩種。Cis結(jié)合的兩個靶標(biāo)位于同一細(xì)胞。這類分子可以通過“雙抗原共表達(dá)”提高選擇性，減少對單陽性細(xì)胞的“on-target/off-tumor”毒性。需精細(xì)調(diào)節(jié)每個臂的親和力，若某臂親和力過高，可因單價結(jié)合而喪失雙價優(yōu)勢。Trans結(jié)合指兩個靶標(biāo)位于不同細(xì)胞。經(jīng)典案例包括免疫細(xì)胞重定向（如TAA×CD3 T-cell engager，或TAA×CD16A NK-cell engager）。

有雙抗，自然有三特異性抗體（trispecifics）。多抗既可以靶向不同抗原，也可以結(jié)合同一抗原不同表位，如雙表位抗體（biparatopic Abs），比如對于ADC藥物，可以促進(jìn)受體聚集、內(nèi)化、溶酶體降解，提升ADC的毒素遞送效率。

提到表位（epitope），又分為“功能性表位”和“非功能性表位”。功能性表位被結(jié)合后可阻斷配體、招募免疫細(xì)胞、促進(jìn)ADC內(nèi)化等。非功能性表位屬于即使被高親和力抗體結(jié)合，也不產(chǎn)生治療收益。所以，高親和力≠高療效，應(yīng)優(yōu)先靶向關(guān)鍵功能殘基或最佳免疫取向的表位。

抗原-抗體相互作用檢測

抗體親和力的測量需根據(jù)靶點特性和結(jié)合復(fù)雜性選擇合適技術(shù)，避免因?qū)嶒炘O(shè)計不當(dāng)而誤解靶點結(jié)合能力。常用技術(shù)分為兩類：固定配體類（如SPR、BLI）、活細(xì)胞結(jié)合類（如流式細(xì)胞術(shù)、KinExA）

表面等離子共振（SPR）

原理：將抗原或抗體固定在金屬芯片表面，實時檢測結(jié)合/解離導(dǎo)致的光學(xué)折射率變化，計算結(jié)合速率（Kon）與解離速率（Koff），得出KD值。

優(yōu)點：高通量、無標(biāo)記；可測動力學(xué)參數(shù)

局限性包括：1）生理相關(guān)性差：固定抗原可能喪失天然構(gòu)象，無法模擬細(xì)胞膜環(huán)境；2）多價結(jié)合干擾：實驗設(shè)計需抑制avidity（如通過低密度固定）；3）緩沖條件與體內(nèi)差異大（pH、離子強(qiáng)度等）；4）超慢解離難測：需長時間洗脫，KD通常僅能測至低皮摩爾級。

活細(xì)胞結(jié)合技術(shù)：流式細(xì)胞術(shù)

原理：用不同濃度熒光標(biāo)記抗體結(jié)合表達(dá)靶抗原的細(xì)胞，通過熒光強(qiáng)度計算半數(shù)結(jié)合濃度（EC50）和最大結(jié)合（Bmax）。

優(yōu)點：保留抗原天然構(gòu)象和膜環(huán)境，適合模擬生理狀態(tài)；可檢測抗體二價結(jié)合導(dǎo)致的avidity效應(yīng)（如EC50降低但Bmax減少）。

局限性包括：1）EC50≠KD：高抗原表達(dá)或avidity會扭曲EC50與真實親和力的關(guān)系；2）假陰性風(fēng)險：抗原-抗體內(nèi)吞或細(xì)胞表面抗原脫落會降低信號，需低溫或固定細(xì)胞緩解，但可能降低生理相關(guān)性；3）需與動力學(xué)技術(shù)（如Ligand Tracer）聯(lián)用以確認(rèn)平衡狀態(tài)。

KinExA（動力學(xué)排阻法）

原理：KinExA是一種基于溶液的親和力測定技術(shù)，不固定任何分子，維持抗原抗體在天然狀態(tài)下的平衡。將不同濃度的抗原與恒定濃度的抗體孵育至平衡，然后將混合物通過包被抗原的微珠，在極短時間（<0.5秒）內(nèi)捕獲游離抗體，再用熒光二抗檢測，從而推算出游離抗體濃度，計算KD值。

優(yōu)點：1）生理相關(guān)性強(qiáng)：無需固定，保留抗原天然構(gòu)象；2）適用范圍廣：可用于膜蛋白、完整細(xì)胞、未純化樣品；3）高靈敏度：可測至fM級別；

局限性包括：1）通量較低：一次只能測一個樣品；2）背景干擾：血清中內(nèi)源性IgG可能產(chǎn)生非特異信號。

單細(xì)胞相互作用細(xì)胞術(shù)（scIC/RT-IC）

原理：將表達(dá)抗原的活細(xì)胞固定在微流控“籠”中，熒光標(biāo)記抗體在流動中通過，實時監(jiān)測抗體結(jié)合與解離，記錄保留時間和熒光強(qiáng)度，評估affinity與avidity。

優(yōu)點：1）真實細(xì)胞環(huán)境：抗原處于天然膜狀態(tài)；2）可測avidity：適合二價或多價抗體；3）動態(tài)監(jiān)測：可觀察親和力成熟后的變化。

缺點是技術(shù)門檻高，設(shè)備復(fù)雜，尚未普及。

功能藥理學(xué)實驗用于親和力測定

原理：當(dāng)抗體作為拮抗劑阻斷受體-配體結(jié)合時，可通過劑量依賴性抑制曲線估算其親和力。

方法包括：1）Cheng-Prus off修正：適用于競爭性抑制，但需確認(rèn)非“tight-binding”系統(tǒng)；2）Schild分析：更嚴(yán)謹(jǐn)，適用于高親和力抗體，可判斷是否真正為競爭性結(jié)合。

用于親和力測定的各種方法的范式、優(yōu)點、缺點和檢測范圍如下表所示。

親和力與PK/PD的關(guān)系

靶點介導(dǎo)的藥物處置（TMDD）

在某些情況下，可溶性靶抗原的大小和功能會決定抗原/抗體復(fù)合物的消除速率，這一現(xiàn)象被稱為靶點介導(dǎo)的藥物處置（TMDD）。一個典型例子是靶向PCSK9的抗體，其整體動力學(xué)呈非線性，消除半衰期較短。通過改造CDR，使抗體在內(nèi)涵體pH6.0時親和力降低，可讓抗體在內(nèi)涵體中與靶抗原解離并被細(xì)胞釋放，從而改變PCSK9的藥代動力學(xué)特征。目前已有多種抗體通過“pH開關(guān)”機(jī)制設(shè)計改善PK。

膜結(jié)合靶標(biāo)也可能出現(xiàn)TMDD：靶抗原可能自然內(nèi)化，或在與抗體結(jié)合后被誘導(dǎo)內(nèi)化。其對抗體的影響取決于全身抗原表達(dá)量與抗體劑量的比例，以及抗體-抗原復(fù)合物的內(nèi)化速率。簡單來說，復(fù)合物內(nèi)化會形成非線性清除途徑，其中清除速率與抗原表達(dá)量、內(nèi)化速率、抗原/抗體親和力相關(guān)。這可能降低細(xì)胞膜上的靶標(biāo)占有率，對于ADC類藥物可能是件好事，對于需要阻斷靶點通路或依賴ADCC發(fā)揮作用的抗體則不利。

抗體分布

抗體親和力會影響其組織分布及到達(dá)靶部位的有效性。例如，“結(jié)合位點屏障假說”（binding site barrier hypothesis）指出，高親和力抗體難以穿透實體腫瘤，因為它們會被困在腫瘤外層抗原密集區(qū)域。此觀點還認(rèn)為高親和力抗體會呈現(xiàn)出不同的分布特征。

抗體與抗原的相互作用可用于改善治療性抗體的組織分布。一個顯著案例是“腦穿梭”（brain shuttling）技術(shù)，該技術(shù)能增強(qiáng)抗體對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的穿透性。其原理是通過基因工程讓抗體包含一個結(jié)合域，該結(jié)合域可與介導(dǎo)內(nèi)源性配體轉(zhuǎn)胞吞作用的受體結(jié)合，其中轉(zhuǎn)鐵蛋白受體是最常用的靶點。此類策略可能顯著改善阿爾茨海默病等疾病的治療效果。

鉤狀效應(yīng)（Hook effect）

“過度擁擠”（Overcrowding）或“自身抑制”（auto-inhibition）是多價、多功能分子的一種特性，可能導(dǎo)致“鉤狀效應(yīng)”——即藥物濃度過高時療效反而下降，這在體外實驗中常用于蛋白水解靶向嵌合體（PROTACs）的研究。在高濃度下，分子會與任一靶標(biāo)形成二元復(fù)合物，從而阻礙功能性活性三元復(fù)合物的后續(xù)形成。這一現(xiàn)象在抗體依賴的ADCC以及T細(xì)胞和NK細(xì)胞銜接子中也需加以考慮。這種雙相濃度-效應(yīng)曲線的形態(tài)取決于抗原的親和力和表達(dá)量，因此適合通過基于數(shù)學(xué)模型的方法進(jìn)行優(yōu)化。

另外，雙抗對兩種可溶性靶標(biāo)均為單價，且可假設(shè)其兩個臂的結(jié)合是相互獨立的。這意味著，在給定抗體劑量下，針對某一靶標(biāo)的結(jié)合位點數(shù)量相較于其單特異性親本抗體減少一半。因此，雙抗的有效劑量應(yīng)為其來源的兩種二價“親本”抗體中較高者的兩倍。