Nature：康熙帝的“救命藥”，合成之謎終獲解

關于金雞納霜（奎寧，又名金雞納堿）這種初代抗瘧疾神藥，網上有幾則流傳甚廣的小故事。清康熙三十二年（1693年）五月，康熙帝患上了瘧疾，高燒不退，御醫束手無策，后來在京的法國傳教士進獻了金雞納霜，療效甚佳，皇帝性命得以保全。此后，康熙五十一年（1712年）七月，曹寅（曹雪芹祖父）染上瘧疾，他向康熙帝討要以曹家之富也無法搞到的金雞納霜，康熙帝不但立刻應允，還“恐遲延，所以賜驛馬星夜趕去”，他叮囑曹寅“若不是瘧疾，此藥用不得，須要認真。”可惜曹寅實在運氣不佳，沒有等到神藥，就不治而亡。

金雞納樹的花與干樹皮。圖片來源于網絡

不論故事的真實性有幾何，以奎寧（quinine，1a）為代表的金雞納生物堿確確實實是一類具有重要臨床應用價值的天然產物，人類使用長達數百年，對這類天然產物的研究也超過兩百五十年。奎寧之外，奎尼丁（quinidine，2a）是重要的抗心律失常藥物，而辛可尼丁1（cinchonidine）和辛可寧2（cinchonine）則廣泛用作不對稱合成中的手性催化劑。有趣的是，這些生物堿的二氫類似物（如：氫化辛可寧丁（1′）、氫化辛可寧（2′）、氫化奎寧（1a′）、氫化奎尼丁（2a′））也可通過植物分離，并顯示出與奎寧、奎尼丁相仿的性質。盡管這些化合物的化學結構早已明確，但其在植物中的生物合成途徑卻長期未被揭示。從生物合成的角度來看，金雞納生物堿屬于單萜吲哚生物堿，理論上由色胺3（tryptamine）和裂環馬錢子苷4（secologanin）經異胡豆苷合酶（STR）催化生成異胡豆苷5（strictosidine），再經酶解脫糖后在還原酶和酯酶的作用下形成dihydrocorynantheal（6'）。植物喂養研究表明6'和corynantheal（6）同系物都經過一系列未知步驟平行轉化并形成假設的吲哚-奎寧環中間體辛可胺（7）和二氫辛可胺（7'），這些中間體再通過一系列未知的化學轉化形成1、1'、2和2'的喹啉核心骨架。另外，喂養研究已證實甲氧基化同系物的生物合成是通過與1和2相同的方式進行，即使用5-甲氧基色胺（3a'）代替3作為吲哚起始前體（圖1）。雖然獲得了一些進展，但corynantheal骨架如何轉化為這些生物堿的機制仍是未解之謎。

近日，德國馬克斯-普朗克化學生態學研究所的Sarah E. O’Connor教授和美國佐治亞大學的C. Robin Buell教授課題組系統地揭示了從corynantheal到最終金雞納生物堿（包括其二氫和甲氧基化衍生物）的完整生物合成途徑，鑒定了所有關鍵中間體，克隆了所有負責這些轉化的酶基因，并進行了功能表征。該研究并未依賴單一技術，而是創造性地整合了經典與前沿的研究方法，形成了一套強大的“組合拳”，具體而言：1）同位素標記與喂養實驗確認了“on-pathway”中間體；2）病毒誘導的基因沉默（VIGS）在植物體內驗證候選基因的功能；3）單細胞核RNA測序獲得高分辨率的細胞類型特異性基因表達譜，精確定位生物合成基因活躍的細胞區域，并用于候選基因篩選；4）比較轉錄組學，跨物種（金雞納、大葉蛇根草、帽蕊木）比較，識別保守的生物合成基因；5）蛋白質組學與酶活性分級分離，從植物粗提物中尋找催化活性并通過質譜鑒定相關蛋白；6）異源表達與酶學表征，在本氏煙草中瞬時表達候選基因，或在大腸桿菌/酵母中純化蛋白進行體外功能驗證。相關成果發表在Nature上。

圖1. 金雞納生物堿的可能生物合成途徑。圖片來源：Nature

早期的實驗表明當將6加入金雞納的細胞培養物中時會迅速被還原為相應的corynantheol（11）。為此，作者化學合成了同位素標記的類似物d5-corynantheol（11b）并將其飼喂于金雞納植物組織，液相色譜-質譜（LC-MS）成功檢測到下游產物d5-cinchonidine（1b）、d5-cinchonine（2b）和d5-cinchonamine（10b），進而證實11是一種“on-pathway”中間體（圖2a-c）。其次，作者還檢測到11b的同位素有效摻入到一種未知代謝產物中（圖2d），通過飼養、LC-MS分析、大規模分離、半合成以及NMR分析證實其為一種全新的季銨化合物并將其命名為chinonium（12，圖2e）。進一步飼喂實驗表明12可轉化為cinchonaminal（7），后者在植物中主要以環化形式cyclocinchonaminal（13）存在（圖2f、2g）。總之，這三個中間體（11、12、13）的發現為重新構建金雞納生物堿的合成途徑提供了關鍵節點。

圖2. 通過飼喂實驗鑒定三種關鍵的中間體（11–13）。圖片來源：Nature

隨后，作者通過共表達分析篩選出30個候選轉移酶并在本氏煙草中瞬時表達，發現一個BAHD家族酰基轉移酶可將11轉化為malonyl-corynantheol（14）。體外實驗證實該酶使用malonyl-CoA作為酰基供體，并將其命名為O-malonyltransferase（MAT）。此外，作者還通過病毒誘導的基因沉默（VIGS）來評估MAT在體內的功能，結果顯示在沉默MAT后，corynantheol及其衍生物在金雞納樹葉中大量積累，這證明MAT在體內確實參與該反應（圖3a）。其次，作者通過整合單核RNA測序、蛋白質組學分析和比較轉錄組學篩選出20個候選基因（圖3c-3f），最終發現另一個BAHD酰基轉移酶家族（即malonyl-corynantheol cyclase（MCC））能夠催化malonyl-corynantheol的環化反應并生成12（圖3g、3h），而且該反應不依賴輔因子，具有嚴格的底物特異性，僅識別malonylated底物。值得注意的是，盡管MAT和MCC同屬BAHD酰基轉移酶家族，但是序列相似性僅19.5%，并且MCC已喪失酰基轉移酶活性，進化出新的環化功能，這一發現拓寬了BAHD酰基轉移酶家族的功能譜。緊接著，作者鑒定出一種2-酮戊二酸依賴性雙加氧酶并將其命名為Cinchonaminal synthase（CiS），其能將12轉化為cinchonaminal（7）。CiS在本氏煙草中表達后可催化12生成13，但同時也生成過氧化產物cinchonaminal acid（15），這表明其活性需被下游酶迅速“捕獲”。CiS產物被進一步還原得到cinchonamine（10），該反應由一種醇脫氫酶Cinchonaminal reductase（CiR）催化。需要指出的是，CiR與CiS在單核RNA測序中呈現共表達模式且在細胞類型上均富集于表皮細胞。進一步發現一個CYP71家族的細胞色素P450酶cinchonaminal oxidase（CiO）能夠催化cinchonaminal的吲哚氧化開環并重排為喹啉結構，從而生成cinchonidinone（8）和cinchoninone（9），這是整個途徑中形成喹啉環的關鍵步驟。VIGS沉默CiO后，13和10顯著積累，而8和9顯著減少，證實了其在體內的功能。金雞納生物堿生物合成的最后一步涉及將8/9還原為最終產物1/2，作者鑒定出一種aldo-keto還原酶Keto-reductase（KR4），后者KR4在體外表現出良好的還原活性，但在本氏煙草中未能檢測到活性。進一步研究發現本氏煙草提取物中含有抑制KR4活性的因子，從而解釋了異源系統中還原步驟缺失的原因。

圖3. MCC 的發現與功能鑒定。圖片來源：Nature

有了這些被鑒定和功能表征的酶，金雞納生物堿生物合成途徑可以在異源宿主本氏煙中重構。具體來說，將廣為人知的中心單萜吲哚生物堿前體5作為底物外源供給本氏煙葉片，這些葉片已經用DCS、DCE、MAT、MCC、CiS和CiO以及一個編碼來自系統發育相關植物長春花的異胡豆苷β-葡萄糖苷酶（CrSGD）的構建體進行了轉化。正如預期的那樣，異胡豆苷被有效地轉化為8'和9'。改用甲氧基化類似物10-OMe異胡豆苷（5a）則導致形成8a'和9a'，這一結果證實了下游酶的底物靈活性，并為先前提出的甲氧基化生物堿的平行生物合成途徑提供了明確的實驗支持。值得注意的是，將STR、T5H、OMT1和液泡異胡豆苷轉運蛋白STTr加入基因堆疊，并用3和4替換5，導致了甲氧基化和非甲氧基化酮式喹啉的混合物形成，進而模擬了這些二氫生物堿在金雞納樹中的存在情況（圖4a）。由于在這些測定條件下，DCS導致形成6'，因此作者測試了合成11作為外源底物用于本氏煙葉盤以觀察8和9的形成（圖4b）。此外，在本研究開始時鑒定的中間體11、12和13，在對這些轉化的本氏煙葉片進行分析時被檢測到。相比之下，當MAT下游的酶（MCC、CiS和CiO）存在時，14是檢測不到的，這一結果與天然金雞納樹代謝物譜中缺乏這種瞬時中間體相一致。總的來說，這些發現凸顯了使用這些生物合成基因進行藥用相關喹啉生物堿生物合成的潛力。

圖4. 喹啉金雞納生物堿的生物合成。圖片來源：Nature

定向生物合成是一種已使用數十年的方法，用于生產工業上重要的天然產物類似物，該方法向生成產物的宿主提供外源非天然起始底物。然而，為了成功生產最終產物類似物，這種方法要求所有下游酶都能催化所有相應非天然生物合成中間體的轉化。由于金雞納生物合成酶天然地作用于甲氧基和二氫衍生物，因此作者推斷這些生物合成酶將非常適合用于生產非天然生物堿類似物。事實上，將轉化了STR、CrSGD、DCS、DCE、MAT、MCC、CiS和CiO的本氏煙葉片滲入一系列3的類似物（如：5-氟色胺、5-氯色胺、6-氟色胺、6-氯色胺、7-氟色胺和7-氯色胺）以及天然輔底物4，發現在所有情況下都觀察到鹵代色胺底物被消耗，同時存在質量數和MS/MS模式與形成相應二氫辛可寧酮和二氫辛可尼酮類似物一致的化合物（圖5），這些結果表明鑒定的生物合成基因可用于生產鹵代的金雞納生物堿類似物，考慮到鹵代喹啉的臨床用途和吸引力，這些類似物可能對藥物化學應用有重要價值。

圖5. 喹啉金雞納生物堿鹵代類似物的生物合成。圖片來源：Nature

總結

本文報道了負責金雞納生物堿獨特的喹啉-奎寧環骨架生物合成的基因，同位素標記、基因沉默、單核RNA測序和比較轉錄組學的結合揭示了幾個意想不到的生物合成轉化過程。作者還描述了一種以前未被報道的季銨鹽中間體，它通過一種不尋常的酶促環化反應生成。這些發現解開了數百年來關于金雞納生物堿骨架如何生物合成的謎團，并凸顯了通過代謝工程方法獲取這些化合物的前景，也為金雞納生物堿的綠色可持續生產和基于合成生物學的藥物研發開辟了全新的道路。

Biosynthesis of cinchona alkaloids

Blaise Kimbadi Lombe, Tingan Zhou, Gyumin Kang, Joshua C. Wood, John P. Hamilton, Klaus Gase, Yoko Nakamura, Ryan M. Alam, Ron P. Dirks, Lorenzo Caputi, C. Robin Buell, Sarah E. O’Connor

Nature,2026, DOI: 10.1038/s41586-026-10227-x