抗體 Fc 糖基重塑介導的定點偶聯技術：ADC 制備的精準化解決方案

聚焦基于抗體Fc糖基重塑的定點偶聯技術，詳細闡述了一種結合兩步酶促反應與無銅點擊化學的抗體 - 藥物偶聯物（ADC）制備方法，核心為商業化的GlyCLICK?技術，旨在解決傳統 ADC 偶聯異質性問題，實現精準、均一的 ADC 制備，同時保留抗體的抗原結合能力并賦予其高效的體內外抗腫瘤活性。

一、研究背景：傳統ADC的痛點與糖基偶聯的優勢

傳統 ADC 化學偶聯方法（馬來酰亞胺結合二硫鍵、胺基偶聯賴氨酸）會產生異質化產物，導致 ADC 循環半衰期縮短、療效降低且存在脫靶效應。而人 IgG 抗體 Fc 域 N297 位的保守 N - 糖基為定點偶聯提供了理想靶點：其位于 Fc 結構域之間，遠離抗原結合位點，化學組成與氨基酸不同，可實現特異性修飾，且不會破壞抗體的核心結合功能。

二、Fc 糖基的主要偶聯技術方向

目前針對 IgG Fc 保守糖基的偶聯技術主要靶向糖基的不同位點，各有特點：

1.核心巖藻糖：通過高碘酸鹽氧化結合酰肼反應偶聯，或代謝工程引入 6 - 硫代巖藻糖實現巰基修飾，保留抗體免疫反應性且穩定性良好；

2.唾液酸：需先酶促添加半乳糖和唾液酸，再通過氧化形成醛基進行肟連接，但易引發甲硫氨酸氧化影響 FcRn 結合，偶聯后藥物抗體比率（DAR）約 1.6；

3.半乳糖：通過 β- 半乳糖苷酶切除天然半乳糖，再經工程化半乳糖基轉移酶（GalT）連接酮基 / 疊氮修飾的半乳糖，可結合無銅點擊化學，為 SiteClick?技術基礎，適用于成像與治療雙功能 ADC 制備；

4.核心GlcNAc：本文核心技術靶點，通過 IgG 特異性內切糖苷酶切除天然糖基暴露核心 GlcNAc，再經酶促修飾與點擊化學偶聯，實現 DAR=2.0 的均一偶聯，為 GlyCLICK? 技術核心。

針對靶向保守型 IgG Fc 聚糖的現有偶聯技術的示意圖

三、核心技術：GlyCLICK? 偶聯技術的原理與流程

GlyCLICK? 技術結合兩步酶促反應與無銅疊氮-炔烴應變促進點擊化學（SPAAC），靶向 Fc 糖基的核心 GlcNAc，實現定點、均一偶聯，核心步驟為：

GlyCLICK 偶聯技術將兩步酶促反應與后續的無銅疊氮 - 炔基點擊化學反應相結合。

第一步：酶促脫糖基，暴露核心GlcNAc

利用鏈球菌來源的EndoS2 內切糖苷酶（Immobilized GlycINATOR），特異性水解 Fc 區的天然復雜糖基，僅保留與天冬酰胺連接的核心 GlcNAc。

該酶可水解所有 IgG 亞類的 Fc 糖基，脫糖基效率 100%，且不會破壞抗體的整體結構；酶以固定化形式存在，反應后可快速分離，避免抗體被酶降解。

第二步：酶促疊氮活化，給抗體“貼”上專屬“標簽”

通過工程化半乳糖基轉移酶 GalT (Y289L)，將帶有疊氮基團（-N3）的半乳糖類似物（GalNAz），精準轉移至暴露的核心 GlcNAc 上。工程化酶的底物特異性被改造，可高效識別 GlcNAc 并連接 GalNAz，實現 Fc 區兩個位點的精準活化；疊氮基團為生物正交基團，在體內不會與其他分子發生非特異性反應，為后續偶聯提供 “專屬接口”。

第三步：無銅點擊化學，實現藥物與抗體的精準“牽手”

利用無銅疊氮 - 炔烴應變促進點擊化學（SPAAC），讓疊氮活化的抗體與環辛炔修飾的細胞毒性藥物發生共價結合，形成穩定的三唑鍵。無需銅離子催化，避免銅離子對抗體和細胞的毒性，反應條件溫和（25℃避光過夜），適合生物大分子；點擊化學的反應特異性接近 100%，僅在疊氮與環辛炔之間發生反應，確保偶聯的位點專一性；

最終得到 Fc 區兩個位點定點偶聯的 ADC，DAR 精準為 2.0，無雜化產物。

四、技術優勢：均一性、功能性與生物學活性

1.高度均一：偶聯后 DAR 精準為 2.0，疏水相互作用色譜（HIC）呈現單一均一峰，無雜化產物；

2.保留抗原結合能力：表面等離子體共振（SPR）分析顯示，偶聯后的 ADC 與親本抗體的抗原結合親和力無顯著差異（曲妥珠單抗 KD=1.33 nM，偶聯后 KD=1.52 nM）；

3.優化的藥代與安全性：脫糖基化破壞了抗體與 Fc-γ 受體的相互作用，降低脫靶效應，同時保留與 FcRn 的結合，維持正常的體內循環半衰期；

4.高效抗腫瘤活性：以抗 uPARAP 抗體偶聯 PBD 二聚體毒素為例，該方法制備的ADC 在體外可高效殺傷腫瘤細胞，對肉瘤患者原代樣本有效，且在體內僅需 2 mg/kg 單劑量即可治愈荷瘤小鼠。

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