一次奇思妙想，讓免疫熒光技術造福人類

Mitchell Leslie| 撰文

齊 萱 | 翻譯

1939年夏天，對許多人而言，是去海灘休閑、探訪親友或在國家公園徒步的好時機。而阿爾伯特·庫恩斯（Albert Coons）卻將時間花在了觀察尸檢上，思考著白血病以及當時細菌感染的常見并發癥——風濕熱等疾病。

此時，這位27歲的年輕人剛在馬薩諸塞州總醫院完成了為期兩年的實習醫師工作，正等待前往波士頓市立醫院擔任助理住院醫師。

六個月的假期結束后，他前往柏林，他有一位朋友在當地的一家醫院擔任病理學家。兩人經常聚在一起探討科學和醫學問題。庫恩斯回憶說，他還將很多時間用于“閱讀或沉思”。有一天，他開始思索風濕熱患者心臟中生長的微小結節。醫生們懷疑，當一種未知的細菌分子引發免疫反應時，這些結節就會形成。然而，要驗證這一假設，他們需要確認引發反應的分子（即抗原）是否隱藏在病變組織中。庫恩斯在醫學培訓期間研究過抗體，他靈機一動，想到可以用一種帶有彩色分子的抗體來標記抗原。

原發性免疫熒光的基本概念示意圖

庫恩斯將這個想法告訴了他的病理學家朋友，但朋友對此不以為然。“我覺得他認為這不可行，”庫恩斯回憶道。然而，這一靈感催生了一種名為免疫熒光的技術，該技術后來成為診斷和研究的主要支柱，當時在哈佛醫學院的庫恩斯也因此獲得了1959年的阿爾伯特·拉斯克基礎醫學研究獎。

免疫熒光技術涉及將熒光化合物附著在抗體上，從而創建出分子定位信標。抗體與抗原（通常是一種蛋白質）結合，并發出信號，表明其在細胞、組織或器官中的存在。“我們每天都在實驗室使用這項技術，”密歇根大學醫學院免疫組織學實驗室的技術總監史蒂文·赫里卡伊（Steven Hrycaj）說道，該實驗室每年分析約15萬份患者樣本。“它挽救了生命。”

赫里卡伊表示，免疫熒光技術的基本原理幾乎沒有改變。“庫恩斯所做的幾乎與我們如今所做的完全一樣。”但近年來，研究人員也為這項技術開發了新的應用，并拓展了其功能。例如，外科醫生已利用免疫熒光技術來界定腫瘤的邊界，使其更易于切除。

現在免疫熒光技術不再局限于單一顏色，而是提供了一系列顏色選擇，從而能夠檢測多種蛋白質。“我們可以在單個樣本上檢測60種不同的抗體，”匹茲堡大學的外科病理學家阿圖爾·辛吉（Aatur Singhi）說道。科學家們也正在努力開發庫恩斯這一創意的更多用途。

神經母細胞瘤培養細胞的免疫熒光顯微照片。熒光染料突出顯示細胞核中的蛋白質（黃色）以及細胞骨架蛋白絲、微管蛋白（綠色）和肌動蛋白（藍色）

庫恩斯稱，他的這一見解“再明顯不過了”。但斯坦福大學的免疫學家休·麥克德維特（Hugh McDevitt）曾撰寫一篇對庫恩斯職業生涯的贊賞文章，他表示，庫恩斯低估了自己的成就。考慮到1939年科學家們對抗體了解甚少，“在抗體分子上添加可見標記的概念似乎既大膽又新穎。”

然而，將這一概念轉化為實用的實驗室技術卻并非易事，庫恩斯在1939年晚些時候回到美國后便深有體會。一方面，他的臨床工作占據了他大部分時間。庫恩斯偶爾進入實驗室時，他嘗試將彩色分子與抗體結合的努力都失敗了。在獲得一個研究獎學金、擺脫臨床工作后，他才開始取得進展。庫恩斯成功地將彩色分子附著在抗體上，并用它們來標記細菌。但結果令人失望，因為“在顯微鏡下，這些生物體只是呈現出淡淡的粉紅色，”他回憶道，“用這種強度的顏色，根本無法在組織中找到少量的抗原。”

為了增強抗體的熒光效果，庫恩斯聯系了哈佛大學的一位有機化學家，后者建議他“‘下樓去和地下室里的兩位研究人員談談，他們已經在將熒光化合物與蛋白質結合了。’”庫恩斯與這兩位研究人員合作，將一種在紫外光下發出藍色熒光的分子附著在能識別某些細菌表面抗原的抗體上。當科學家們將標記的抗體添加到細菌樣本中時，這些微生物“在紫外光下呈現出明亮的熒光，”庫恩斯寫道。1941年的一篇論文介紹了他們的研究成果。

但這只是第一步，庫恩斯希望能在患者樣本中檢測抗原。然而，在紫外光下，組織自然會產生一種藍色熒光，掩蓋了標記抗體的信號。為了解決這個問題，他和同事們換用了一種新的標記物——一種能發出綠色熒光的化合物，這種化合物能在人體自然的藍色背景下脫穎而出。他們還請來了一位哈佛大學的化學專業研究生來合成這種化合物。在給抗體裝備上這種分子后，研究人員表明，他們能夠在小鼠組織中定位細菌。

當他們取得這一突破時，美國已卷入了第二次世界大戰。庫恩斯很快以醫生的身份加入了軍隊。他在橫跨全國的火車上撰寫了描述團隊研究成果的論文，以便能夠前往南太平洋執行任務。一位同事將論文提交給了一家期刊，但庫恩斯承認，直到1943年，當期刊的副本“在澳大利亞布里斯班送到我手中時，我正準備登船前往北部的巴布亞新幾內亞”，他才得知論文的發表情況。

庫恩斯在美國陸軍擔任了四年的病理學家和醫院實驗室服務主任。1946年回到哈佛后，他希望繼續開展免疫熒光技術的研究。之前實驗的試劑仍存放在校園的冰箱里，但由于他的化學同事都不愿意制作他所需的熒光標記物，他不得不自己學習合成。庫恩斯與不同的研究人員合作，對這項技術進行了微調，并在1950年和1951年發表的研究中展示了其威力。例如，團隊表明，免疫熒光技術可以檢測小鼠體內的病毒。庫恩斯很快轉而研究人體如何產生抗體。

在后來的歲月里，免疫熒光技術因其特異性、分辨率和簡便性而在世界各地的診斷實驗室中占據了一席之地。赫里卡伊表示，他的實驗室每天對大約20個樣本進行這項檢測。赫里卡伊說，免疫熒光技術并非從組織樣本中做出診斷的唯一選擇。病理學家通常更喜歡一種名為免疫組織化學的類似技術——該技術涉及用與非熒光分子結合的抗體來標記抗原——因為它更快且更便宜。使用免疫組織化學技術，只需一臺標準的明場顯微鏡即可觀察組織樣本的切片，而免疫熒光技術則需要更昂貴的熒光或共聚焦顯微鏡。盡管如此，免疫熒光技術仍是診斷某些腎臟和皮膚疾病等病癥的首選方法。“當我們需要尋找非常敏感的東西，并且需要進行量化時，免疫熒光技術就大放異彩了，”辛吉說道。不過，他表示，免疫熒光技術成本較高且需要專門的設備，這使一些診所望而卻步。

成纖維細胞的免疫熒光顯微照片；細胞核呈紫色，微管呈紅色

最近的進展提高了免疫熒光技術的診斷價值。庫恩斯和他的同事們一次只能檢測一種抗原。一種名為多重免疫熒光的新技術于過去十年間問世，它可以使用不同的抗體同時定位多種抗原，每種抗體都帶有獨特的顏色。辛吉表示，這種能力對患者來說非常重要，因為病理學家可以從小的組織樣本中提取更多信息。“免疫熒光的未來在于多重檢測，”他說道。

出于與臨床醫生相同的許多原因，科學家們也在工作中采用了免疫熒光技術。“在研究中，它是標準方法，”赫里卡伊說道。這項技術之所以具有啟發性，是因為它可以確定特定蛋白質的位置、數量以及它們之間的相互作用——這些信息對于細胞生物學家、神經科學家、免疫學家、癌癥生物學家和其他研究人員來說至關重要。與二維的免疫組織化學不同，免疫熒光技術可以使研究人員在三維空間中分析蛋白質的分布，從而更清晰地了解組織的結構和功能。

范德比爾特大學醫學中心的埃本·羅森塔爾（Eben Rosenthal）等研究人員為免疫熒光技術開發了新的應用。“我們已經將其推進到了下一個合理的階段，那就是將其應用于患者，”同時也是頭頸外科醫生的羅森塔爾說道。大約20年前，羅森塔爾和他的團隊開始測試注射熒光抗體是否可以通過標記腫瘤邊緣來幫助外科醫生，因為腫瘤邊緣往往難以與健康組織區分開來。這些研究以及其他科學家的研究表明，這項技術可能有益。羅森塔爾表示，使用免疫熒光技術，“你可以在手術室實時識別癌癥”，一些外科醫生也使用這項技術來指導手術刀的操作。

羅森塔爾和他的同事們目前正在努力確定免疫熒光技術是否可以幫助醫生選擇接受免疫檢查點抑制劑治療的患者，并微調這些基于抗體的癌癥治療的劑量。檢查點抑制劑在十多年前首次獲得美國食品藥品監督管理局（FDA）的批準，得克薩斯大學MD安德森癌癥中心的詹姆斯·艾利森（James Allison）因此獲得了2015年拉斯克-德貝基臨床醫學研究獎，并分享了2018年諾貝爾生理學或醫學獎。羅森塔爾表示，研究人員仍未確定這些治療的最佳劑量。“令人驚訝的是，我們認為這是精準醫療，但我們給每個人都使用相同劑量的抗體。”他表示，確定最有效的劑量尤為重要，因為這些藥物每劑的成本約為1萬美元。

盡管檢查點抑制劑對20多種癌癥有效，并能治愈一些患者，但只有約20%的接受者能從中受益。羅森塔爾和他的同事們希望提高這一比例。他們之前使用熒光標記抗體的研究表明，這些藥物往往無法在腫瘤中均勻分布。“有些區域藥物無法到達，”他說道。今年，研究人員啟動了一項臨床試驗，以確定修改藥物劑量是否能使藥物分布更加均勻。參與者均為頭頸部癌癥患者，他們將接受不同劑量的檢查點抑制劑帕尼單抗以及一種改良版的熒光標記抗體。在手術切除腫瘤后，羅森塔爾和他的同事們將測量樣本中的熒光強度，以確定帕尼單抗在癌組織中的滲透程度，從而推斷出最有效的劑量。羅森塔爾表示，如今患者接受的是他們所能承受的最高劑量，但這種藥物“可能在最大耐受劑量的二分之一或三分之一時就能發揮作用”，這可能會減少副作用并提高治療效果。

麥克德維特指出，庫恩斯性格靦腆，“對于自己的方法取得了如此廣泛的成功，他仍感到有些驚訝，甚至有些尷尬。”庫恩斯寫道，他之所以能提出自己的標志性想法，是因為他做了大量的知識儲備，并且有時間讓“潛意識發揮作用”。他寫道，通往創造性突破的道路是“首先，用事實充實頭腦，并為之奮斗；然后是潛伏期；最后，突然領悟到解決方案。”

https://laskerfoundation.org/albert-coonss-bright-idea/

青科沙龍第167期：琥珀酸促進CD8+ T細胞干性及其抗腫瘤功能研究；馬凱麗（中國醫學科學院蘇州系統醫學研究所副研究員）

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