PNAS | 海軍軍醫大學李兆申/黃浩杰揭示腸肽酶如何精準激活胰蛋白酶原

胰腺消化穩態的維持依賴于胰蛋白酶原的正確激活，這一過程由十二指腸刷狀緣絲氨酸蛋白酶——腸肽酶（Enteropeptidase, EP）特異性催化。腸肽酶通過識別胰蛋白酶原N端的DDDDK序列，精準切割激活肽，啟動消化酶級聯反應。腸肽酶功能缺陷可導致嚴重消化不良，而其異常 reflux 則與急性胰腺炎等病理狀態密切相關。盡管腸肽酶的生物學重要性明確，但其如何通過重鏈中的非催化結構域（如CUB2）實現大分子底物的高效識別與切割，分子機制長期不明。

2026年3月16日，《美國國家科學院院刊》（PNAS）在線發表了海軍軍醫大學李兆申、黃浩杰、Ding Zhanyu團隊題為《Structural insight into the CUB2 domain's role in enteropeptidase-mediated trypsinogen activation》的研究論文。該研究通過冷凍電鏡技術結合功能分析，首次高分辨率揭示了腸肽酶-胰蛋白酶原復合物的三維結構，闡明了CUB2結構域通過表面電荷與環區動態調控底物切割效率的分子基礎。

研究團隊首先通過構建N端截短體（EP504-1019），發現去除CUB2上游結構域后，腸肽酶對胰蛋白酶原的切割效率顯著降低，證實CUB2、LDLR2及SRCR構成的大分子底物切割核心單元中，CUB2直接介導底物識別。隨后對CUB2結構域18個殘基進行丙氨酸掃描，發現E574A突變體切割活性增強，而N619A、D578A等突變體效率顯著下降，提示表面帶電殘基對活性調控至關重要。

為解析其分子機制，研究團隊解析了腸肽酶-胰蛋白酶原復合物2.95 ?的高分辨率結構。結構顯示，腸肽酶重鏈形成拱形結構包裹催化輕鏈與底物，胰蛋白酶原尾部呈現兩種構象：State-1中尾部懸于CUB2-MAM連接區，State-2中則深入催化中心。CUB2通過L573-D578與N619-R624兩個環區與底物相互作用，E574與D578形成局部負電區域，與底物負電表面產生靜電博弈，N619則鄰近DDDDK序列引導其進入活性位點。

進一步解析E574A與N619A突變體的單獨及底物結合結構發現，E574A消除了局部負電，增強底物親和；N619A則因表面負電增強產生靜電排斥，導致結合顆粒比例降低。表面等離子體共振實驗顯示各變體結合親和力相當，表明CUB2主要調控切割速率而非初始結合。底物結合后，突變體間電荷差異消失，提示交聯劑可能掩蓋動態靜電效應。

基于構象差異，研究提出腸肽酶蛋白水解循環模型：CUB2-MAM連接區通過T515與P517識別DDDDK序列，啟動底物招募；MAM與CUB結構域引導底物向核心區遷移；CUB2表面電荷（E574、N619）調控尾部進入催化中心的效率；最終催化口袋完成切割，釋放活性胰蛋白酶，腸肽酶恢復動態構象進入下一循環。該模型揭示了非催化結構域通過動態靜電匹配精準調控絲氨酸蛋白酶活性的普遍機制。

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