華南理工大學AM：有機硒水凝膠為糖尿病傷口愈合帶來新希望

糖尿病傷口愈合一直是臨床醫學面臨的重大挑戰。這類傷口之所以難以愈合，根源在于其特殊的病理微環境形成了惡性循環：氧化應激持續存在、晚期糖基化終末產物及其受體（AGE-RAGE）不斷積累、慢性炎癥反復發作，三者相互促進，使傷口無法進入正常的修復階段。盡管現有的抗氧化水凝膠在一定程度上能夠清除活性氧，但它們往往無法同時干預AGE-RAGE信號通路，且由于交聯速度過快，難以完美貼合不規則創面，導致治療效果大打折扣。

近日，華南理工大學邊黎明教授、趙鵬超教授、徐夏憶教授和斯坦福大學Cui Miao合作，報告了一種組織適形的有機硒水凝膠（TCOH），通過微相分離調控酰腙交聯動力學，實現了對糖尿病傷口微環境的多靶點調控。該水凝膠系統由可微相分離的有機硒聚合物（OSP）和透明質酸-己二酸二酰肼（HA-ADH）組成，能夠在注射后緩慢凝膠化，完美貼合不規則創面，并通過高密度有機硒基團同時清除活性氧、分解AGEs，從而重建氧化還原穩態，促進血管新生，調控巨噬細胞極化。相關論文以“Tissue-Conforming Organoselenium Hydrogel with Microphase-Controlled Acylhydrazone Crosslinking Kinetics Expedites Diabetic Wound Healing by Inhibiting AGE-RAGE Pathways”為題，發表在

Advanced Materials

研究團隊首先通過RAFT聚合合成了含苯甲醛的共聚物PFA，進而偶聯有機硒前體得到OSP。核磁共振、凝膠滲透色譜和X射線光電子能譜等多種表征手段證實了有機硒基團的成功引入，硒元素含量達到3.9 wt%。OSP在水溶液中通過疏水相互作用形成明顯的微相分離結構，這種微相分離將苯甲醛基團包裹在疏水微區內，從而延緩了與HA-ADH的酰腙交聯反應。流變學測試顯示，TCOH的凝膠化時間延長至20分44秒，而對照組水凝膠（ConH）僅需1分14秒即完成凝膠化。這一延長的凝膠化窗口使得TCOH前體溶液能夠注入并完美貼合五邊形模具等復雜幾何表面，展現出優異的組織適形性和粘附性能。

圖1 | 組織適應型有機硒水凝膠（TCOH）用于糖尿病傷口愈合的示意圖。A) OSP的微相分離控制TCOH的酰腙交聯動力學。B) 具有優異組織適應性和氧化還原穩態能力的TCOH通過雙重重塑氧化還原和AGE-RAGE穩態加速糖尿病傷口愈合。

完全交聯后，TCOH的儲能模量達到約4.0 kPa，在頻率掃描測試中儲能模量始終高于損耗模量，在應變掃描中線性粘彈區可達46%應變。循環應變測試表明，TCOH在300%高應變破壞后能夠在1%低應變下快速恢復，展現出優異的自愈合性能。掃描電鏡和能譜分析證實，TCOH具有微孔結構，硒元素均勻分布于整個水凝膠基質中。抗氧化性能評估顯示，在100 μM H2O2模擬病理條件下，TCOH在24小時內顯著清除氧化應激，并通過谷胱甘肽消耗實驗證實了其再生性抗氧化能力。

圖2 | 疏水性有機硒介導的OSP微相分離賦予TCOH卓越的傷口適應性和再生性ROS清除能力。(A) OSP疏水性有機硒介導的微相分離示意圖和顯微鏡觀察。比例尺 = 20 μm。(B) TCOH延遲原位凝膠過程的可視化觀察。(C) TCOH對不規則圖案的增強適應性。比例尺 = 5 mm。(D) 兩種水凝膠的流變時間掃描證實，與ConH的快速凝膠化相比，TCOH的凝膠化動力學延長。(E) 2小時完全交聯后，TCOH和ConH具有相當的儲能模量 (n = 3)。(F) TCOH對豬皮表現出顯著的適應性和 (G) 組織粘附性，而ConH則相形見絀 (n = 3)。比例尺 = 10 mm。(H) TCOH和ConH的流變頻率和 (I) 應變掃描。(J) TCOH的流變步應變振蕩時間掃描表明其良好的自修復性能。(K) SEM和EDS表征驗證了TCOH的微孔結構和硒組分的均勻分布。比例尺 = 10 μm。(L) TCOH表現出再生性氧化還原能力，循環ROS和GSH清除實驗證明了這一點 (n = 3)。統計學意義：ns，不顯著；p < 0.05，p < 0.01，p < 0.001，****p < 0.0001。

在細胞層面，CCK-8實驗證實TCOH對NIH/3T3成纖維細胞無細胞毒性。在LPS刺激的巨噬細胞模型中，TCOH處理顯著降低細胞內ROS水平，同時下調M1型標志物CD86表達，上調M2型標志物CD206表達。RT-qPCR分析進一步證實，TCOH下調促炎基因（iNOS、IL-6、TNF-α）表達，上調抗炎基因（Arg-1、IL-10、TGF-β）表達，有效誘導巨噬細胞從促炎M1表型向修復性M2表型轉化。

圖3 | 具有卓越細胞內ROS清除能力的TCOH誘導巨噬細胞從M1向M2復極化。(A) TCOH處理顯著降低了LPS刺激的細胞內ROS表達（DCFH-DA作為熒光ROS探針）至未處理PBS對照水平，而ConH通過免疫熒光染色顯示出有限的ROS清除能力（綠色為ROS探針，藍色為細胞核）。比例尺 = 50 μm。(B) ROS探針的相對熒光強度 (n = 20)。(C) TCOH處理誘導巨噬細胞從M1向M2復極化的示意圖。(D) 免疫熒光染色結果表明，與LPS和ConH處理的對照組相比，TCOH處理顯著下調了巨噬細胞上CD86（M1標志物，綠色）的表達，同時上調了CD206（M2標志物，綠色）的表達。比例尺 = 50 μm。(E) CD86和CD206生物標志物的相對熒光強度 (n = 20)。(F) M1巨噬細胞標志物（CD86和IL-1β）的基因表達 (n = 4) 以及 (G) M2巨噬細胞標志物（CD206和IL-10）的基因表達，通過RT-qPCR分析評估 (n = 4)。兩種水凝膠組中所有生物標志物的免疫熒光強度統計分析 (n = 20)。統計學意義：ns，不顯著；p < 0.05，p < 0.01，p < 0.001，****p < 0.0001。

在H2O2誘導氧化應激的人臍靜脈內皮細胞模型中，TCOH處理有效清除細胞內ROS，恢復細胞增殖能力。劃痕實驗顯示TCOH顯著恢復H2O2損傷的內皮細胞遷移能力。更為重要的是，在Matrigel管形成實驗中，TCOH處理使分支數量增加2.8倍，總分支長度增加5.1倍，而ConH組僅分別增加1.4倍和1.5倍，證實TCOH能夠有效促進血管新生。

圖4 | 具有卓越細胞內ROS清除能力的TCOH促進細胞增殖、遷移和血管生成。(A) TCOH保護HUVECs免受ROS損傷、細胞增殖、遷移和血管生成的示意圖。(B) 與未處理PBS對照相比，TCOH顯著中和了H2O2誘導的高ROS表達（DCFH-DA作為熒光ROS探針），而ConH通過免疫熒光染色表現出有限的ROS清除能力（綠色為ROS探針，藍色為細胞核）。比例尺 = 50 μm。(C) ROS探針的相對熒光強度 (n = 20)。(D) EDU染色結果表明，TCOH處理通過改善ROS損傷促進了HUVECs的增殖（紅色為EDU探針，藍色為細胞核）。比例尺 = 50 μm。(E) EDU探針的相對熒光強度 (n = 20)。(F) 在0、12和24小時，經歷不同處理的HUVECs的劃痕傷口愈合實驗。比例尺 = 400 μm。(G) 劃痕實驗的定量分析表明與對照組相比，TCOH 處理顯著加快了傷口閉合率（n = 3）。（H）不同處理后 HUVEC 的管形成能力。（I）分支數量（n = 3）和（J）分支總長度的定量分析表明，TCOH 處理顯著促進了嚴重氧化應激下 HUVEC 的管形成（n = 3）。比例尺 = 50 μm。兩個水凝膠組中所有生物標志物的免疫熒光強度統計分析（n = 20）。統計顯著性：ns，不顯著；p < 0.05，p < 0.01，p < 0.001，以及 ****p < 0.0001。

在鏈脲佐菌素誘導的糖尿病小鼠全層皮膚缺損模型中，TCOH單次應用顯著加速傷口閉合，至第14天剩余傷口面積僅0.96% ± 0.40%，顯著優于ConH和空白對照組。H&E染色顯示TCOH組傷口炎癥浸潤明顯減少，肉芽組織空間顯著縮小，接近正常皮膚結構。Masson三色染色顯示TCOH組膠原沉積高度有序，形成類似真皮的籃織結構。重要器官的H&E染色未觀察到明顯病理損傷，證實了TCOH的良好生物相容性。

圖5 | TCOH加速糖尿病小鼠傷口愈合。(A) 圖示工作流程，說明糖尿病小鼠傷口模型的建立以及通過單次應用原位形成TCOH處理糖尿病傷口的實驗時間線。(B) 第0、3、9和14天小鼠模型的代表性照片和 (C) 傷口痕跡表明TCOH處理顯著加速了傷口閉合。比例尺 = 4 mm。(D) 第0、3、9和14天小鼠模型傷口面積百分比的定量分析 (n = 6)。(E) 第14天小鼠模型傷口組織H&E染色的代表性圖像，黃色箭頭突出放大圖像中的炎癥區域。比例尺 = 400 μm（左）和 50 μm（右）。(F) TCOH、ConH和空白組處理傷口炎癥區域的定量分析 (n = 6)。(G) TCOH、ConH和空白組處理愈合傷口肉芽組織間隙的定量分析 (n = 6)。(H) 第14天小鼠模型傷口組織Masson三色染色的代表性圖像。比例尺 = 400 μm（左）和 50 μm（右）。(I) TCOH、ConH和空白組處理傷口組織膠原容積分數的定量分析 (n = 6)。統計學意義：ns，不顯著；p < 0.05，p < 0.01，p < 0.001，****p < 0.0001。

免疫熒光染色顯示，TCOH處理使傷口組織內ROS水平降低97%，CD206/CD86比值顯著升高，證實了其體內ROS清除能力和巨噬細胞表型重塑功能。CD31免疫組化染色顯示，TCOH組在第9天和第14天均呈現顯著更高的血管密度，表明其促進血管成熟的能力。

圖6 | TCOH通過病理性ROS中和、M2巨噬細胞極化和增強血管生成加速糖尿病小鼠傷口愈合。(A) 愈合皮膚組織的免疫熒光染色表明，與ConH和PBS處理組相比，TCOH處理顯著減少了傷口誘導的高ROS表達（DHE作為熒光ROS探針）（紅色為ROS探針，藍色為細胞核）。比例尺 = 200 μm。(B) 第14天，經PBS（空白）、ConH和TCOH處理的糖尿病小鼠傷口模型愈合皮膚組織中二氫乙錠（DHE）染色區域的定量分析 (n = 6)。(C) 愈合皮膚組織的免疫熒光染色表明，與PBS和ConH處理的對照組相比，TCOH處理顯著下調了CD86（M1標志物，紅色）的表達，同時上調了CD206（M2標志物，綠色）的表達（藍色為細胞核）。比例尺 = 50 μm。(D) 第14天，經PBS（空白）、ConH和TCOH處理的糖尿病小鼠傷口模型愈合皮膚組織中CD206（綠色）和CD86（紅色）染色區域的定量分析 (n = 6)。(E) 愈合皮膚組織的IHC染色表明，與第9天和第14天的ConH和PBS處理組相比，TCOH處理顯著促進了血管生成。比例尺 = 100 μm。(F) 第9天和第14天，經PBS（空白）、ConH和TCOH處理的糖尿病小鼠傷口模型愈合皮膚組織中CD31陽性區域的定量分析 (n = 6)。統計學意義：ns，不顯著；p < 0.05，p < 0.01，p < 0.001，****p < 0.0001。

轉錄組學分析揭示，TCOH處理上調1024個基因，下調724個基因。GO富集分析顯示谷胱甘肽過氧化物酶相關基因顯著富集，ELISA檢測證實傷口組織內源性GSH水平升高。KEGG和GSEA分析顯示AGE-RAGE和NF-κB信號通路顯著抑制，IL-17信號通路下調，p53通路激活。Western Blot驗證了TCOH處理顯著降低RAGE蛋白表達，抑制NF-κB磷酸化，同時上調GPX1表達，從蛋白水平證實了多靶點調控機制。

圖7 | TCOH、ConH和空白處理的糖尿病傷口組織的轉錄組學分析 (n = 3)。(A) 圖示說明TCOH處理下糖尿病傷口愈合的潛在分子信號通路。TCOH和空白處理組之間差異表達基因的（B）抗氧化調節和（C）巨噬細胞極化調節的基因本體論（GO）富集分析。(D) TCOH和空白處理組之間差異表達基因的KEGG富集分析。TCOH和空白處理組之間的（E）AGE-RAGE和（F）NF-κB信號通路的GSEA分析。TCOH和ConH處理組之間差異表達基因的（G）傷口修復增強和（H）糖脂代謝校正的GO富集分析。(I) TCOH和ConH處理組之間差異表達基因的KEGG富集分析。(J) TCOH、ConH和空白處理傷口組織中表達的RAGE、p-NF-κB、NF-κB和GPX1蛋白的代表性WB圖像。(K) WB結果的定量分析 (n = 3)。統計學意義：ns，不顯著；p < 0.05，p < 0.01，p < 0.001。

總而言之，這項研究通過將動態材料適應性與多靶點病理調控相結合，成功開發出一種組織適形有機硒水凝膠，能夠通過催化清除ROS和分解AGE-RAGE結合雙重重塑病理微環境，驅動M1向M2巨噬細胞極化轉變，同時促進血管新生，加速功能性傷口愈合。這一創新平臺不僅為糖尿病傷口治療提供了新策略，也為其他具有相似氧化還原失衡和慢性炎癥病理特征的慢性疾病治療開辟了新途徑。