FSHW | 果膠低聚糖糖基化修飾通過調節細胞因子表達和Th1/Th2免疫平衡來降低蝦原肌球蛋白的致敏

本文系Food Science and Human Wellness原創編譯，歡迎分享，轉載請授權。

Introduction

南美白對蝦因其細膩的風味和全面的營養成分而成為世界各地流行的海鮮。然而，蝦被歸類為“八大”食物過敏原之一。南美白對蝦是一種常見的過敏性食物，在食品法典委員會和許多國家的食品標簽上都顯示在。對南美白對菌過敏的患者即使因少量蝦而面臨風險，過敏反應可引起與運動引起的過敏反應一樣嚴重的癥狀。事實上，全球超過2.5%的人口對原肌球蛋白（TM）、精氨酸激酶（AK）、肌球蛋白輕鏈（MLC）和肌漿鈣結合蛋白（SCP）等蝦蛋白有IgE介導的I型過敏反應。分子量為31～42 kDa的TM是南美白對蝦的主要過敏原，南美白對蝦是一種酸性糖蛋白，對蛋白酶、酸和熱處理具有良好的穩定性。TM具有高度保守的氨基酸序列，72%～98%的患者在純化的TM中表現出陽性IgE反應。通過食品加工降低過敏性是減少TM過敏原的適當方法，但如今理想的加工方法有限。

降低蝦類食物過敏原致敏性的方法通常包括物理處理（如加熱、微波、高強度超聲、超高壓、輻照）和糖基化反應等。糖基化修飾因具有位點特異性強、反應條件溫和等優勢，已成為食品過敏領域中改變蛋白質功能特性的潛在方法。研究表明，核糖、殼寡糖等還原糖與中國對蝦TM的糖基化反應可使后者致敏性降低高達60%。糖基化修飾可降低α-乳清蛋白的致敏活性并改變其多級結構。除葡萄糖、核糖等常用單糖外，低聚半乳糖（GOS）、殼寡糖（COS）、果膠寡糖（POS）等寡糖也被用于降低蛋白質致敏性。其中，低聚半乳糖可通過影響Th1/Th2細胞因子平衡，調控蝦TM誘導的食物過敏。也有研究提出利用低聚半乳糖和低聚果糖（FOS）降低雞卵類粘蛋白（OVM）致敏性的方法。

研究發現，果膠寡糖作為益生元，可通過誘導免疫相關因子調控免疫穩態，進而預防和減輕過敏反應。迄今為止，利用果膠寡糖對TM進行糖基化修飾以降低其致敏性的研究相對較少。因此，本研究從凡納濱對蝦中提取并鑒定過敏原蛋白TM，分析其二級結構并預測抗原表位；隨后采用低聚半乳糖醛酸（GA）對TM進行糖基化修飾，檢測其體外IgE結合能力；同時構建BALB/c小鼠糖基化修飾TM過敏模型，探究其抗過敏效果及作用機制。

Results and Discussion

TM的純化和鑒定

南美白對蝦蛋白經過熱處理、等電沉淀、硫酸銨沉淀和透析脫鹽后的純化情況如圖1A所示，結果表明，高度純化的蛋白質在SDS-PAGE上顯示為分子量約為35 kDa的單條帶。蝦TM的分子量為32～38 kDa，因此推測該條帶為TM。該方法純化的TM收率約為3.41 mg/g。此外，肽片段是在用胰蛋白酶消化純化的蛋白質時產生的。通過質譜/質譜（MS/MS）進一步分析有效峰。共有26種肽匹配不同的蛋白質。匹配的肽與來自Lit v 1 TM、肌球蛋白重鏈1型和肌球蛋白重鏈2型的比對氨基酸序列具有89.4%、22.9%和23.2%的同一性，分數匹配超過90。Lit v 1 TM的氨基酸序列如圖1B所示。在284個氨基酸中，28個賴氨酸（K）和21個精氨酸（R）具有潛在的糖基化位點。TM的蛋白質二級結構如圖1C所示。兩種分析都表明，Lit v 1 TM的蛋白質二級結構主要為α-螺旋結構。

圖1 南美白對蝦TM的SDS-PAGE分析和蛋白質性質分析

原肌球蛋白的糖基化程度

分子量變化可用于反映糖基化程度。與TM（圖2A）相比，糖基化后，GA-TM具有更高的分子量（GA-TM＞DGA-TM＞DH-TM＞TM）。游離氨基含量和碳水化合物含量的改變是反映糖基化程度的重要標志物。如數據所示（圖2B），TM的游離氨基含量最高，與之前報道的數據一致。與TM相比，GA-TM的游離氨基含量降低（TM＞DH-TM＞DGA-TM＞GA-TM）（圖2B）。用于評估糖基化反應進展的碳水化合物含量，如數據所示（圖2C）。DGA-TM導致TM上的糖基化程度高于GA-TM（DGA-TM＞GA-TM＞TM＞DH-TM）。這可能是因為DGA-TM的聚糖幾乎是GA-TM的兩倍，導致碳水化合物含量更高。據報道，AGE可以作為有效的表位發揮作用并增加食物過敏的風險。如圖2D所示，與TM相比，糖基化TM的AGEs含量顯著更高（GA-TM＞DGA-TM＞TM＞DH-TM），因此表明高聚合度（DGA-TM）比低聚合度（GA-TM）對AGEs的產生有更少的貢獻。

圖2 TM與還原糖糖基化反應的進展

糖基化反應誘導TM構象改變，致敏降低

由于糖基化反應修飾了TM的氨基酸殘基，從而改變了一級結構。通過遠紫外CD分析了TM和相關反應產物（圖3A）。結果表明，TM的二級結構主要為α-螺旋，而不是β-折疊、β-轉角或無規則卷曲，覆蓋了整個蛋白質的83.44%左右。反應結束時，GA-TM和DGA-TM的α-螺旋含量下降了35%以上。相反，β-折疊結構的含量隨著反應的進行而逐漸增加。這些結果表明，糖基化反應通過誘導從α-螺旋到β-折疊的交替來改變TM構象。紫外吸收光譜TM構象的結構變化反映在紫外吸收的變化上。如圖3B所示，DGA-TM和GA-TM樣品中的吸光度峰出現了2.0和4.0 nm的紅移。此外，TM在不同條件下糖基化時，吸光度峰在波長上的偏移、紫外吸收峰也存在差異。如圖3C所示，與TM相比，糖基化產物的熒光強度顯著下降，從TM的710.3下降到DGA-TM的503.5和GA-TM的404.8，表明蛋白質極性發生變化，芳香族氨基酸轉移到更親水的環境中。通過ELISA與過敏患者血清測定了TM和相關糖基化反應產物的過敏性。如圖3D所示，GA-TM和DGA-TM可以消除TM的大部分致敏性（＞40%）。這些結果證明了糖基化反應在消除TM過敏性方面的有效性，這可以作為未來過敏性食品加工的潛在方法。

圖3 糖基化對TM結構變化和體外致敏的影響

糖基化修飾緩解TM引起的食物過敏

糖基化修飾可緩解過敏癥狀

蝦過敏小鼠模型表現出典型的過敏反應。臨床過敏反應癥狀是反映過敏程度的直觀指標，包括過敏和腹瀉評分、體質量變化以及直腸和體表溫度。與對照小鼠相比，所有TM致敏小鼠都表現出反應。食物過敏會導致小鼠體質量緩慢增加和體溫異常下降，這與血管舒張引起的供血溫度降低有關。從無花果中可以看出。S4A-E，過敏導致小鼠體質量增加減少、恐懼和腹瀉、直腸和體表溫度降低以及過敏癥狀。相比之下，GA-TM和DGA-TM的治療，小鼠過敏癥狀可得到緩解（P＜0.05）。

小鼠血清中IgE、HIS和細胞因子的評估

小鼠模型開發中普遍接受的標準是誘導對過敏成分的特定IgE反應并通過優化的ELISA技術進行定量。如圖4A-C所示，與對照組相比，TM組的IgE和IgG1水平顯著升高（P＜0.05），IgG2a水平相反（P＜0.05）。GA-TM和DGA-TM處理后，IgE水平分別降低32.82%和52.53%。血清中的組胺水平可能因過敏原的致敏而異。與TM相比，GA-TM和DGA-TM顯著降低了圖4D中的組胺釋放（P<0.05）。Th1/Th2免疫失衡是過敏的誘因之一。探討糖基化對Th1/Th2平衡的影響，檢測到代表性細胞因子IFN-γ（Th1）和IL-4（Th2）。如圖4E和F所示，TM顯著降低了IFN-γ的含量（P＜0.05），并顯著提高了IL-4的水平（P＜0.05），這表明T細胞傾向于Th2極化，引起過敏反應。盡管如此，糖基化的處理減輕了TM誘導的Th1/Th2失衡。通過與葡聚糖糖化聯合緩解牛奶蛋白過敏患者。IFN-γ和IL-4的比值常被用作確定Th1/Th2細胞分化狀態的指標。如圖4G所示，TM組Th1/Th2水平下降了74.43%，而GA-TM和DGA-TM促進了Th1/Th2的表達（P＜0.05）。這些結果表明，TM可能會破壞過敏小鼠的Th1/Th2平衡。糖基化可能通過下調Th2相關細胞因子和上調Th1細胞因子來調節Th1/Th2失衡，從而抑制TM過敏反應，從而導致食物過敏癥狀加重。

圖4 糖基化對小鼠（A）IgE、（B）IgG1、（C）IgG2a、（D）HIS、（E）IFN-γ、（F）IL-4和（G）Th1/Th2釋放的影響

糖基化減輕空腸損傷

食物過敏會破壞腸道屏障，容易使過敏原侵入人體，加重過敏。在TM模型中通過HE染色觀察到小鼠腸道屏障的變化（圖5A）。與對照組相比，TM、小鼠存在明顯的腸道損傷。然而，GA-TM組小鼠腸道損傷較少，DGA-TM組表現出正常的組織學特征，并表現出完整的絨毛結構。在腸上皮細胞中，杯狀細胞增強了腸道穩態和耐受性。因此，在TM模型中檢查了小鼠空腸杯狀細胞的含量。如圖5B所示，GA-TM和DGA-TM組的杯狀細胞水平與TM組相比顯著降低（P＜0.05）。活化的肥大細胞釋放了無數炎癥介質，最終導致通常與過敏反應相關的臨床癥狀的發展。如圖5C所示，肥大細胞聚集，細胞膜破壞和邊界不規則且擴散，而在GA和DGA治療后，肥大細胞數量較TM減少（P＜0.05）。結果表明，糖基化修飾不僅能緩解TM誘導的過敏癥狀，還能減少過敏癥狀引起的腸道損傷。

圖5 小鼠空腸切片的觀察

糖基化修飾調節過敏因子

為更好地理解糖基化修飾對TM潛在致敏性的影響，本研究通過qPCR檢測了小鼠脾臟中Th1偏向性、Th2偏向性、Treg偏向性及Th17偏向性細胞因子和轉錄因子的表達水平。結果顯示，TM組和DH-TM組中Th1偏向性細胞因子（IFN-γ）和轉錄因子（T-bet）的表達水平顯著降低（圖6A）。對于Th2偏向性細胞因子IL-4和轉錄因子GATA-3的mRNA表達水平，所有實驗組均較對照組顯著升高（圖6B）。此外，為探究Th17/Treg應答平衡的變化，本研究檢測了TGF-β、IL-17以及關鍵轉錄因子FOXp3和RORγt的表達情況。GA-TM組和DGA-TM組中TGF-β和FOXp3的表達水平均高于TM組，且差異具有統計學意義（圖6C）。相反，GA-TM組和DGA-TM組小鼠體內IL-17和RORγt的表達水平顯著低于TM組（圖6D）。上述結果表明，糖基化修飾的TM處理可通過改善小鼠體內Th17與Treg細胞的失衡狀態降低其致敏性。各組關鍵緊密連接（TJ）蛋白的表達及定位結果顯示，這些蛋白不僅受致敏作用調控，還受上皮細胞中微生物群組成的影響。TM激發后，TJ蛋白（ZO-1、Occludin和Claudin-1）的表達水平顯著下降（P＜0.05）（圖6E），其中TM組上述蛋白水平分別較對照組降低58%、52%和55%。DGA-TM組的ZO-1、Occludin和Claudin-1水平顯著升高（P＜0.05），而GA-TM組無顯著升高。上述結果表明，DGA-TM可通過上調TJ蛋白表達維持腸道屏障完整性，保護腸上皮屏障免受損傷。

圖6 糖基化TM對細胞因子和空腸TJ表達的影響

Conclusion

綜上所述，通過LC-MS/MS鑒定純化的TM為Lit v 1，潛在表位分布在肽鏈上。GA和DGA的糖基化改變了TM的構象，暴露了芳香族氨基酸殘基，并顯著降低了體外IgE結合能力。GA-TM和DGA-TM不足以刺激BALB/c小鼠過敏，TM的糖基化修飾改善了IgE、IgG1、HIS、IL-4和關鍵轉錄因子GATA-3、IL-17和RORγt的分泌，促進了細胞因子IFN-γ、T-bet、TGF-β和Foxp3的表達，促進了Th1/Th2和Treg/Th17之間的平衡。此外，糖基化修飾的TM增加了腸道TJ蛋白的表達，降低了TM致敏。總體而言，具有過敏潛力的純化蛋白質可能會引起敏感個體的嚴重過敏反應，這些致敏蛋白的糖基化可能是對抗蝦過敏的有效方法。

Pectin oligosaccharides glycosylation modification reduced the sensitization of shrimp tropomyosin by regulating cytokines expression and Th1/Th2 immune balance

Mengya Zhaoa,1, Chunyu Wua,1, Jing Liub, Xinian Lia, Zhenpeng Gaoa, Xin Yangc, Di Liua, Fangyu Longa,*

a College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China

b Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Guizhou Academy of Agricultural Sciences, Guiyang 550005, China

c College of Animal Science and Technology, Northwest A&F University, Yangling 712100, China

1 Both authors contributed equally.

*Corresponding author.

Abstract

Tropomyosin (TM) is the predominant allergenic protein in shrimp, which has induced IgE-mediated food allergy reactions. In this study, Lit v 1 was purified from Penaeus vannamei muscles, which were glycosylated by pectic oligosaccharides. The results showed that di-galacturonic acid (DGA) and galacturonic acid (GA) induced the unfolding of the primary protein structure of TM, and changed α-helical structure, and IgE binding capacity. In addition, compared with TM-sensitized BALB/c mice, GA-modified TM (GA-TM) and DGA-modified TM (DGA-TM) were insufficient to stimulate sensitization, and significantly reduced the hypersecretion of IgE, IgG1, HIS, and IL-4, up-regulated IgG2a and IFN-γ levels to improve imbalanced Th1/Th2, Treg/Th17 immunity, and promoted mRNA expression of tight junction proteins. Together, this study confirmed that glycosylation modification alleviated sensitization by altering TM structure, reducing IgE binding allergic inflammatory response, and regulating cytokine immune balance. Overall, these results indicated that glycosylation modification was a promising method for decreasing the allergenic reactivity of allergic proteins.

Reference:

ZHAO M Y, WU C Y, LIU J, et al. Pectin oligosaccharides glycosylation modification reduced the sensitization of shrimp tropomyosin by regulating cytokines expression and Th1/Th2 immune balance[J]. Food Science and Human Wellness, 2025, 14(5): 9250301. DOI:10.26599/FSHW.2024.9250301.

翻譯： 田雨欣（實習）

編輯：梁安琪；責任編輯：孫勇

封面圖片：攝圖網

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