《食品科學》：中國農業大學梁志宏教授等：赭曲霉毒素A降解酶研究進展

真菌毒素是霉菌在特定的環境條件下產生的有毒次級代謝產物。常見的真菌毒素主要包括黃曲霉毒素（AF）、赭曲霉毒素（OT）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、伏馬菌素、展青霉素等，其中AF因其強致癌性備受關注，而OT則因其腎毒性和免疫毒性而受到廣泛研究。OT主要由曲霉屬（

Aspergillus

）和青霉屬（

Penicillium

）等絲狀真菌產生，以 赭曲霉毒素A（OTA） 最為典型。中國、巴西、新加坡等國家以及歐盟、國際食品法典委員會等機構都對各類食品或飼料中的OTA含量進行了限制或規范控制（表1）。

控制OTA可以從預防污染、去除毒素等方向著手。目前，OTA去除方法主要包括物理、化學和生物治理3 類。OTA降解酶因其高效性、特異性及環境友好性而受到廣泛關注。OTA降解酶能夠特異性降解OTA，將其轉化為無毒的產物，從而避免游離毒素在特定條件下的再釋放及二次污染。此外，與完整微生物降解相比，酶法處理在不利于微生物生存的條件下仍可保持降解活性，適用范圍更廣，為食品和飼料安全提供了一種更為可行的解決方案。

中國農業大學食品科學與營養工程學院的牛澤慧、梁志宏*全面整合當前關于OTA降解酶的研究成果，深入探討其種類及降解機制、表達系統選擇以及表達優化策略，重點梳理影響酶表達量、活力、耐熱性、耐酸性的關鍵策略與方法，旨在推動OTA降解酶在食品與飼料安全領域的實際應用。

1 OTA降解酶的種類和機制

如圖1所示，水解、內酯環開環、羥基化和結合是OTA代謝的四大主要途徑。OTA在堿性條件下可通過內酯環開環生成劇毒的內酯開放型OTA（OP-OTA）。在人類、豬和大鼠等動物體內，OTA主要通過細胞色素P450酶或過氧化物酶（PO）催化生成多種羥基化產物。動物體內也發現過OTA的己糖和戊糖綴合物。OTA的水解主要通過酰胺鍵斷裂，生成無毒的OTα和L-

-苯丙氨酸。牛、羊、鹿等反芻動物瘤胃中的原生生物能夠將OTA降解為OTα，而微生物對OTA的降解同樣主要依賴該途徑。

目前已挖掘、鑒定、表征出的OTA降解酶眾多，但主要為作用于酰胺鍵的水解酶類。具體分為羧肽酶和酰胺水解酶（ADH）兩大類，兩者都能將OTA降解為OTα和L-

-苯丙氨酸。

1.1 羧肽酶

羧肽酶是最早發現和經過廣泛研究的OTA脫毒酶，它的來源多樣，包括牛胰腺、釀酒酵母（

Saccharomyces cerevisiae

）、溶桿菌屬CW239（

Lysobacter

sp. CW239）、解淀粉芽孢桿菌ASAG1（

Bacillus amyloliquefaciens

ASAG1）、不動桿菌ITEM 17016（

Acinetobacter

sp.

neg

1 ITEM 17016）、短波單胞菌ML17（

Brevundimonas naejangsanensis

ML17）和枯草芽孢桿菌CW14（

B. subtilis

CW14）等。

源于牛胰腺的羧肽酶A（CPA）（EC 3.4.17.1）是首次報道的OTA水解酶，在25 ℃條件下的Km為1.5×10-4 mol/L。應用計算機/體外（

in silico/in vitro

）工作流程將虛擬篩選與酶活力測定相結合的技術，篩選到了來源于豬的羧肽酶B（CPB）（EC 3.4.17.2），CPB同樣具有OTA水解能力，3.325 mg/mL CPB能夠在180 min內將OTA質量濃度從97.0 ng/mL降低至93.1 ng/mL，活性約為CPA的1/8。來源于釀酒酵母的羧肽酶Y（CPY）（EC 3.4.16.1）在酶質量濃度0.1 mg/mL、pH 5.6、37 ℃的反應條件下，對1 μg/mL OTA的降解率達到52%。細菌來源的羧肽酶同樣也具有OTA降解能力。Wei Wei等從Lysobacter sp. CW239中表征了一種新型羧肽酶cp4，0.25 mg/mL cp4蛋白24 h內對10 ng/mL OTA的降解率僅能達到36.8%。從

B. subtilis

CW14中挖掘到的dacA是一種絲氨酸型的D-丙烯酰-D-丙氨酸羧肽酶，1 μg/mL粗酶液與1 μg/mL OTA在37 ℃條件下混合孵育24 h，降解率達到71.3%。Peng Mengxue等從

B. naejangsanensis

ML17的胞外代謝物中純化出能夠降解OTA的4 種酶，其中降解能力最優異的是絲氨酸羧肽酶BnOTase2，對1 μg/mL OTA的降解率達到100%，以OTA為底物時Km為0.92 μmol/L，該酶同時具有降解OTB的能力。

CPA作為一種鋅肽酶，針對其結構及作用機制的研究頗多，但其作用機制仍存在一定爭議。其中普遍認可的催化機制是：CPA活性位點的Zn2＋與H69、E72、H196和水分子結合，水分子與E270之間形成氫鍵。當底物酰胺鍵的羰基氧與Zn2＋結合時，水分子發生移位，E270從水分子中提取質子，生成羥基離子（OH-），后者攻擊酰胺鍵的羰基碳原子，形成四面體過渡態。Y248通過氫鍵穩定過渡態，促進酰胺鍵的斷裂，釋放產物（圖2）。豬源CPB是牛胰腺源CPA的同源物，兩者具有44.7%的序列同一性。分子動力學模擬結果表明，CPB和CPA在底物識別模式上具有一定相似性，其共同特征為OTA分子中的苯丙氨酸基團深度嵌入酶的表面裂縫中，同時酰胺鍵穩定地定位于催化Zn2＋離子附近。然而，該推測仍需通過實驗手段進一步驗證。

1.2 ADH

ADH是目前研究最為完善、降解能力最為優異的一類OTA降解酶。

Stander等在對23 種商業化酶制劑進行篩選后，發現源自黑曲霉（A

. niger

）的粗脂肪酶（商品名Amano TM lipase A）對OTA具有顯著的降解活性，其比酶活力達到7.63 U/μg（1 U為每分鐘降解1 μmol/L OTA所需要的酶量）。Abrunhosa等探究了幾種商業蛋白酶對OTA的降解能力，并從A. niger MUM 03.58中分離出具有良好降解能力的粗酶提取物Ancex。在pH 7.5、37 ℃的條件下，蛋白質量濃度為0.112 mg/mL的Ancex在25 h內對1 μg/mL OTA的降解率達到99.8%，通過實驗推斷，參與Ancex中水解OTA的酶是一種金屬蛋白，且OTA降解能力優于CPA。Dobritzsch等進一步分析了Amano TM lipase A中的OTA降解活性成分，鑒定出一種An14g02080編碼的酰胺酶，即新型的OTA酶（OTase），在黑曲霉中進行了N端截短的同源表達。0.7 μg/mL OTase與50 μg/kg OTA孵育60 min后，底物含量降低至25 μg/kg，其活性約為CPA的600 倍。同時OTase具有良好的耐熱性，在pH 6、66 ℃的條件下降解活性最佳。

從微嗜酸寡養單胞菌CW117（

Stenotrophomonas acidaminiphila

CW117）中得到的酰胺水解酶SaADH3在1.2 μg/mL的蛋白質量濃度下90 s內能夠將50 ng/mL OTA完全轉化為OTα和L-

-苯丙氨酸，是目前降解效果最優異的OTA水解酶。

S. acidaminiphila

CW117中還存在一種

N

-酰基-

L

-氨基酸酰胺水解酶NA，該同工酶的催化效率較SaADH3相差29 112.82 倍，但是基因敲除實驗證明了NA不僅能夠保證SaADH3的高效表達，還能夠提高SaADH3的穩定性。后續Hu Yumei等通過GenBank數據庫挖掘得到來自假黃色單胞菌屬（

Pseudoxanthomonas wuyuanensis

）的酰胺水解酶PwADH，該蛋白與SaADH3具有76%的蛋白質序列一致性。PwADH水解OTA的比活性是信號肽截短SaADH3（signal peptide-devoid SaADH3，SP-devoid SaADH3）的7.3 倍，二者分別為2 277 U/mg和310 U/mg（1 U為在最佳條件（40 ℃和pH 7.5）下每分鐘降解1 μg OTA所需的酶量）。

ADH是一類作用于分子內酰胺鍵的水解酶，通常由多個亞基組成，每個亞基都含有一個活性部位，其超家族的結構特征為其保守的單核或雙核金屬中心。通過X射線衍射或冷凍電鏡技術已對OTase、SP-devoid SaADH3及PwADH的蛋白結構進行了解析，這3 種ADH均為同型八聚體，具有保守的催化中心，在結構和降解機制上表現出高度一致性。OTase的亞基結構包括一個扭曲的磷酸丙糖異構酶（TIM）桶以及一個較小的

-三明治夾心結構域。SP-devoid SaADH3在整體結構上與OTase及其他ADH相似，但底物進入通道區域存在一定結構差異；PwADH不僅在該區域有所不同，底物結合口袋以及分子間相互作用等方面也表現出差異，這些特征可能與其更高效的OTA降解能力密切相關。以SP-devoid

Sa

ADH3為例，其OTA降解機制為：首先，金屬離子

與OTA酰胺鍵的羰基氧相互作用，使羰基極化，進行親核攻擊；隨后，保守D344的側鏈從橋接氫氧化物中提取一個質子，該質子應與兩個金屬離子配位；最后，去質子化的橋接氫氧根攻擊碳氮鍵，通過質子化的D344提供一個質子裂解碳氮鍵（圖3）。

除OTase及

Sa

ADH3之外，其他ADH也具有高效的OTA降解能力，能數小時甚至數分鐘內降解90%以上的OTA。來自缺陷短波單胞菌HAU429（

Brevundimonas diminuta

HAU429）的BT6和BT7，在酶質量濃度均為10 μg/mL的條件下，能夠在1 h內100%降解1 μg/mL的OTA。從鮑曼不動桿菌HAU425（

A. baumannii

HAU425）中挖掘出的酰胺水解酶Amse，在酶質量濃度為5 μg/mL時，5 min即可實現降解93%的1 μg/mL OTA。來源于

Lysobacter

sp. CW239的ADH2，在酶質量濃度為1 μg/mL時，可在5 min內100%降解50 ng/mL的OTA。此外，從綠僵菌ARSEF 3297（

Metarhizium brunneum

ARSEF 3297）中獲得的酰胺水解酶MbAmh1，在酶質量濃度為2.5 μg/mL、溫度為60 ℃的條件下，3 min即可實現對1 μg/mL OTA的完全降解。卓越的OTA降解能力說明，以ADH為靶點進行OTA降解酶的挖掘與優化是開發高效解毒工具的重要手段。

1.3 其他酶

脂肪酶、酯酶、蛋白酶、Nudix水解酶、PO和漆酶等都具有一定的OTA降解能力。來自于黑曲霉的粗脂肪酶能夠將OTA降解為OTα和苯丙氨酸。Jahan等分離并鑒定了1 株OTA降解菌貝萊斯芽孢桿菌IS-6（

B. velezensis

IS-6），通過轉錄組學分析，從IS-6中發現了3 種有OTA降解能力的酶，分別為Nudix水解酶Nh-9、羧酸酯酶Ce-3和信號肽酶Sp-2。純化的Nudix水解酶Nh-9（酶質量濃度為1 mg/mL）表現出最高的OTA降解能力，在37 ℃條件下，24 h內針對1 μg/mL OTA的降解率達到68%。從污泥植物中分離得到的坦式不動桿菌DSM 14970T（

A. tandoii

DSM 14970 T ）中挖掘到具有酯酶活性的

α/β

水解酶（

α/β

hydrolase，ABH），對OTA、OTB以及幾種類似物均表現出水解能力。Abrunhosa等從商業蛋白酶中篩選獲得的黑曲霉來源的蛋白酶A及豬胰腺來源的胰酶，均能有效水解OTA生成OTα，使用10 mg酶處理1 μg/mL OTA，25 h內的降解率分別為87.3%和43.4%，相比之下，酸性蛋白酶Prolyve PAC的降解率僅為3%。商業PO以及從米糠中提取的PO均具有降解OTA的能力，其K m 分別為0.27 μmol/L和6.5 μmol/L。在酶濃度為0.063 U/mL、OTA初始質量濃度為10 ng/mL的條件下，兩者在5 h內的OTA降解率分別為41%和59%（1 U表示酶在每分鐘內催化1 μmol底物轉化為1 μmol產物的酶活力單位）。源自巨大芽孢桿菌HNGD-A6（

B. megaterium

HNGD-A6）的漆酶Attm在80 ℃、pH 8.5、酶質量濃度20 ng/mL的條件下，24 h內對2.5 mg/kg OTA的降解率為81.32%。同時該酶也表現出對AFB1及ZEN的降解活性。

雙功能酶是指蛋白質的一條肽鏈上同時具有兩種不同催化活性的酶，能夠催化2 種不同反應。Stander等從“AmanoTM lipase A”中得到的粗脂肪酶不僅具有對硝基苯基棕櫚酸酯降解能力，還能夠水解OTA。Sánchez-Arroyo等發現了3 種能夠降解OTA的酶，分別為具有ADH和雙加氧酶活性的PsSDO、具有羧肽酶和氨基酰化酶活性的AfOTH和具有ADH和酯酶活性的ABH。除了通過基因組序列分析、虛擬篩選等挖掘菌株中存在的天然雙功能酶外，還可以利用融合或重組基因工程技術得到對多種真菌毒素具有降解作用的融合多功能酶。Azam等通過交叉聚合酶鏈式反應技術克隆了基因

zhd101

cp

，并表達純化出新型重組融合酶ZHDCP，100 μg ZHDCP能夠在2 h和30 min內100%降解5 mg/kg ZEN和5 mg/kg OTA，具有玉米赤霉烯酮內酯水解酶和羧肽酶雙功能活性。

近年來OTA降解酶研究匯總如表2所示。

2 OTA降解酶表達系統及表達優化策略

天然OTA水解酶受限于產量低、成本高及提取復雜，難以滿足工業需求。通過基因工程、蛋白質工程及分子生物學技術，可利用微生物宿主以較低的勞動力投入和經濟成本表達高產量、高活性的酶。基于此，可進一步優化酶的表達量、催化活性、耐熱性及耐酸性，以提升其在工業化生產與應用中的適應性和可行性。

2.1 OTA降解酶表達系統

選擇合適的表達系統至關重要，否則可能因錯誤折疊或修飾導致低表達或無表達。目前，OTA降解酶的表達研究主要集中于大腸桿菌和畢赤酵母等傳統表達系統。

大腸桿菌（

Escherichia coli

）表達系統因生長快、成本低、操作成熟、背景清晰，成為主流表達平臺。目前OTA降解酶表達所使用的載體以pET系列（如pET-28a（＋）、pET-32a（＋））為主，均可以實現在

E. coli

BL21（DE3）、Rosetta等宿主中高效表達OTA降解酶。但大腸桿菌表達系統易形成包涵體，且缺乏翻譯后修飾，影響工業應用。

相比于原核表達系統，真核表達系統在一定程度上彌補了其功能缺陷。畢赤酵母（

Pichia pastoris

）表達系統具備分泌表達能力，不僅能簡化下游純化流程，還能有效提升蛋白的活性和溶解度。其中，pPIC9K載體結合AOX1強啟動子調控，在甲醇誘導下可高效表達OTA降解酶。此外，畢赤酵母適合進行高密度培養，其表達系統的蛋白產量可達每升數克級，適用于工業化生產。

其他表達系統在OTA降解酶生產中的研究尚不充分，但它們各自具備一定優勢，并且在未來的發展中具有較大的應用潛力。曲霉來源的ADH OTase采用黑曲霉表達系統進行同源表達，利用

A. niger

AP4表達菌株和pGAPT載體完成蛋白表達與純化。由于目的基因與宿主基因組相近，該表達方式可提高蛋白折疊及翻譯后修飾效率，避免密碼子優化或大幅改造，具有更高的生物相容性。Goo等利用

S. cerevisiae

2805（攜帶載體yEP352ADH1）成功表達牛胰腺CPA，經胰蛋白酶處理獲得比活力為4×10 -3 U/mg的成熟CPA。然而，釀酒酵母在蛋白表達應用中仍存在局限性，如啟動子調控能力弱、糖基化修飾不足。Zhang Dachuan等使用無細胞蛋白質合成（CFPS）系統，在4 h內成功表達了10 種預測的OTA降解酶。利用靶向酶反應混合物的上清液，在OTA底物質量濃度為1 μg/mL、反應時間為3 h的條件下進行降解測定，結果顯示OH1、OH4和OH6降解了體系內超過90%的OTA，而OH8幾乎可完全消除OTA。CFPS系統表達允許人們以開源的方式直接控制轉錄、翻譯和代謝，相較于體內系統具有耗時短、操作簡單和有效性突出等直接優勢，這一優勢使其在降解酶的高通量篩選與大規模生產方面具有極高的應用潛力。

2.2 表達量和酶活力優化策略

在OTA降解酶的實際生產和應用過程中，表達量和酶活力是需要重點關注的兩個指標。從工業應用的角度來看，成本隨著降解酶表達產量的增加而降低，但過高的表達量可能導致蛋白質錯誤折疊或細胞代謝負擔，反而降低酶活力和整體降解效率，只有表達量和酶活力達到合理匹配時，降解酶才能在工業或環境應用中發揮最大效能。在實驗過程中，要實現高水平的蛋白表達量與適宜的酶活力，不僅與目標蛋白本身的性質密切相關，還需要采取一系列措施進行優化，如基因設計（例如密碼子優化、信號肽優化、分子伴侶融合表達等）、表達系統或載體的選擇以及優化表達條件等（圖4）。

2.2.1 基因設計

對目標基因進行合理設計是影響蛋白表達水平和酶活力的重要策略，可以從多個層面優化基因元件及其表達系統，密碼子優化使其更符合宿主表達偏好，針對信號肽序列進行設計以提高分泌效率，輔以分子伴侶增強蛋白的折疊及穩定性。

不同的物種在使用通用密碼子時存在偏好性。對外源基因尤其是具有高稀有密碼子含量的蛋白質基因進行密碼子優化可以顯著提高目標蛋白的表達水平。已有諸多OTA降解酶在表達生產過程中進行了密碼子的優化。Shi Lei等根據畢赤酵母密碼子偏好性合成牛胰腺源CPA酶原（ProCPA）基因，并利用畢赤酵母表達系統生產ProCPA酶原，表達上清液中ProCPA質量濃度為150 μg/mL，占上清液總蛋白質量濃度的80%。目前雖無實驗直接驗證密碼子優化對OTA降解酶表達量和酶活力的影響，但已有其他真菌毒素降解酶研究表明，提高密碼子適應指數可顯著提升蛋白表達水平。因此，密碼子優化必然是一種增強OTA降解酶表達和催化活性的有效策略。

對信號肽的處理也會影響蛋白表達量及酶活力。Xiong Lu等經過分子動力學模擬發現CPA的N端靈活性高，易影響蛋白質的穩定性，所以表達了無前肽和信號肽的成熟CPA（M-CPA）。與表達未截短的ProCPA相比，截短信號肽的操作不僅簡化了使用胰蛋白酶活化的步驟，而且使M-CPA的降解能力提高了29.13%，降解率為93.36%，Km由0.126 mmol/L降低至0.102 mmol/L，表達量增加1 倍左右，從150 μg/mL增加至303.08 μg/mL。但針對于信號肽的處理還應根據目標蛋白的情況具體分析，輕易截短信號肽可能會影響蛋白質的正確折疊、結構和功能。Zhang Xuanjun等截短SaADH3的N端信號肽后進行表達，發現信號肽的去除對酶活力有顯著影響，與SP-devoid SaADH3的酶活力相符。

在其他真菌毒素降解酶的表達生產中，使用適當的分子伴侶是提升表達量及酶活力的常用策略。Jiang Lixiang等將伏馬毒素B1降解酶FumDM與分子伴侶PDI和CPR5共表達，其酶活力分別達到了259.47 U/mL和161.34 U/mL，分別是原始酶活力的635%和357%，同時酶的表達水平也在一定程度上有所提高。轉錄組學分析發現降解酶中的特定氨基酸與分子伴侶互作，分子伴侶幫助蛋白正確折疊，從而提升降解酶的酶活力及表達量。未來在OTA降解酶的生產與表達研究中，應用分子伴侶將成為優化降解酶特性的重要且有效的手段。

2.2.2 表達系統或載體選擇

使用畢赤酵母表達系統進行OTA降解酶生產的可溶蛋白表達量較大腸桿菌表達系統的可溶蛋白表達量通常高一個數量級左右。Shi Lei和Seddi等分別使用大腸桿菌ADA494和畢赤酵母GS115表達了牛胰腺源ProCPA，表達量分別為150 μg/mL和4 μg/mL，相差37.5 倍。這種情況與大腸桿菌系統所生產重組蛋白易產生包涵體有密切關系，在大腸桿菌ADA494表達系統中，僅有30%的重組ProCPA以胞內可溶形式存在。Zhang Xuanjun等利用大腸桿菌和畢赤酵母分別表達了3 種ADH——SaADH3、ADH1和AMD3，進行了高拷貝數整合的畢赤酵母表達系統可以將可溶蛋白的表達量提升至大腸桿菌可溶蛋白表達量的15.78～51.53 倍。

而不同表達系統對酶活力的影響與酶本身特性和表達系統選擇都有一定的關系。Dai Longhai等分別構建了大腸桿菌和畢赤酵母的表達系統，對SP-devoid SaADH3進行異源表達，發現不同表達系統對酶活力影響較為輕微。類似的結果亦在PwADH表達的相關研究中得到驗證。而Zhang Xuanjun等[68]的實驗結果表明，不同表達系統對ADH的酶活力產生了影響。使用大腸桿菌表達系統時，3 種水解酶活力依次為SaADH3＞AMD3＞ADH1，而使用畢赤酵母表達系統得到的3 種水解酶活力發生了顯著下降，酶的催化效率（Kcat/Km）依次為AMD3＞SaADH3≈ADH1。考慮到畢赤酵母表達蛋白純化過程使用了高鹽離子濃度的緩沖液進行洗脫，通過實驗初步推測高鹽離子濃度對酶活力存在一定的抑制作用。

重組蛋白的表達會受到啟動子強度和所使用表達載體拷貝數的影響，應根據不同的需求選擇合適的表達菌株和載體。pGEX-4T-1載體含有促溶標簽——谷胱甘肽轉移酶，

E. coli

BL21菌株不涉及額外的調控機制（如T7 RNA聚合酶或稀有tRNA的表達），減少了代謝壓力。Luo Han等選擇pGEX-4T-1載體與

E. coli

BL21菌株組合，實現了超高效OTA降解酶S

a

ADH3的表達，但僅有＜5%的蛋白位于可溶部分，其余以包涵體的形式存在，仍需進一步優化表達系統或條件。Sánchez-Arroyo等利用非依賴性連接克隆質粒pURI3-Cter和

E. coli

BL21（DE3）菌株表達來自

A. tandoii

DSM 14970T的雙功能酶ABH，蛋白產量達到6.9 μg/mL，37 ℃的條件下純化酶在16 h內只能部分降解濃度為5 μmol/L的OTA。通過基因工程的手段對表達載體拷貝數進行改造會影響重組蛋白的表達量。應用Biobrick方法構建含1～4 個拷貝的玉米赤霉烯酮內酯水解酶基因zhd表達盒的質粒，并通過實驗發現用含有3 個拷貝的

zhd

表達盒的質粒轉化重組畢赤酵母X3c中蛋白表達量最高。

2.2.3 表達條件優化

重組蛋白的表達過程會受多種物理條件的影響，通過優化表達條件提高蛋白表達量是非常傳統有效的手段，如低溫誘導有助于大腸桿菌中目標蛋白的正確折疊和可溶性表達。

表達水平的優化主要涉及的變量條件包括溫度、誘導劑濃度、誘導時間、誘導pH值等，使用單因素試驗或響應面試驗進行優化都是切實可行的方法。Xu Xinge等優化了大腸桿菌生產OTA降解酶DacA的誘導表達條件，發現在IPTG濃度0.5 mmol/L、誘導時間8 h、誘導溫度25 ℃的條件下，重組蛋白的表達水平達到了42.8 μg/mL，相較于優化前提高了23%。Zhang Xuanjun等通過優化3 種ADH在畢赤酵母表達過程中甲醇終濃度、誘導時間等條件，綜合OTA降解率和細胞密度等因素確定高拷貝轉化體，得出ADH1、S

a

ADH3、AMD3的最適甲醇添加量、最佳發酵時間。王曉云等在單因素試驗的基礎上，利用響應面法優化牛胰腺源CPA畢赤酵母表達的條件，確定最終優化參數為甲醇每24 h添加量為0.5%，誘導pH值為5.9，誘導表達前OD600 nm為6.54，在此條件下，CPA的表達量能夠達到0.325 mg/mL，且實驗值與理論值的相對誤差僅為0.38%，說明響應面法優化得到的參數準確可靠。

在其他真菌毒素降解酶的生產過程中，表達條件的優化不僅能夠提高表達水平，還會對酶活力存在正向影響。Hong Feng等通過在搖瓶和配備有甲醇傳感器系統的2.5 L發酵罐中使用畢赤酵母生產重組漆酶，比較不同的發酵策略，發現溫度和甲醇濃度對酶活力都有顯著的影響，推測與蛋白質穩定性、蛋白質折疊有關，發酵罐生產漆酶的活力是搖瓶生產漆酶活力的7 倍。

2.2.4 其他措施

針對于酶本身的改造也會對酶的表達生產及活性產生影響。酶的固定化將酶束縛或限制于一定區域內，能夠提高酶的穩定性，增加酶活力，還具有優異的可回收性和重復利用性。Ma Lei等將聚乙烯吡咯烷酮包被的CPA固定到沸石咪唑酸鹽骨架材料中，CPA均勻地分散于材料中，固定后CPA對底物的轉化率提高了3 倍，降解率較游離CPA提高了30.69%，且固定化使CPA的可再生性提高，循環使用10 次后，復合酶仍保留了初始活力的71.37%。郇佳欣等通過一步原位固定法制備了鋅金屬有機框架負載的脂肪酶A（ANL@Zn-MOF）。與游離酶ANL相比，OTA降解效率顯著提高。ANL@Zn-MOF在較低酶質量濃度（10 ng/mL）下即可完全降解50 ng/mL OTA；在與游離酶ANL相同酶質量濃度（均為20 ng/mL）下將降解時間縮短至1/3；此外，ANL@Zn-MOF在循環使用5 次后仍保持78%的降解活性，展現出良好的穩定性。

基于結構或功能運用計算機（

in silico

）工具完成蛋白質活性位點的預測，結合分子對接及分子動力學模擬等手段，考察突變及改造對目標蛋白穩定性、折疊以及與底物結合的影響，從而對蛋白質進行設計，是酶活力提升的有效途徑。Dai Longhai等針對SP-devoid S

a

ADH3中距離底物結合中心較遠的3 個活性位點殘基進行基于結構的理性設計，發現S88的3 個帶電殘基定點突變體的酶活力較野生酶都有一定的提升，其中S88E的酶活力提高了3.7 倍；解析突變體與底物的復合體結構發現，E88與OTA的OTα部分形成了氫鍵相互作用，有利于OTA構象的穩定和酶活力的提高。類似的工作也在針對PwADH的研究中進行，突變體G88D的酶活力提高了1.2 倍，其酶活力提高的機制也與SP-devoid S

a

ADH3相似。

2.3 耐熱性和耐酸性優化策略

在OTA降解酶的實際應用中，耐熱性、耐酸性是決定其工業化潛力的關鍵特性。許多降解酶在不適宜的環境條件下（如高溫或酸性環境）活性降低甚至失活，從而限制了其在食品加工、飼料處理中的脫毒應用。通過理性設計和固定化等策略對OTA降解酶進行改造，以調節其耐熱性和耐酸性，可以有效增強降解酶在實際應用中的適應性，克服工業化應用中的限制。

酶的耐熱性是其在高溫工業環境中廣泛應用的關鍵因素。Xiong Lu等對牛胰源CPA進行去除前肽及信號肽（M-CPA）的處理后，酶的熱穩定性增強。M-CPA的最適溫度較商業CPA（S-CPA）提高了10 ℃，在高于60 ℃的條件下，M-CPA的熱穩定性略優于S-CPA。利用計算機工具，根據蛋白質的氨基酸序列和結構快速、大量地預測目標區域和位點，是進行蛋白質耐熱性改造的趨勢和方向。Ming Yue等利用分子動力學模擬選擇了CPA中柔性環的3 個β-轉角位置，并利用氨基酸偏好性和多重計算機輔助理性設計確定了兩個突變體R124K和S134P，兩個突變體在45 ℃條件下的半衰期、半失活溫度和熔融溫度3 個方面都有明顯的提升。研究解析了突變體熱穩定提高的分子機制，突變體的分子間作用力的變化使構象更加緊密。Zhang Haoxiang等通過B因子和均方根波動值確定了CPA的柔性區域，并從中選擇了氨基酸殘基對作為突變位點，結合保守區域分析和分子動力學模擬得到兩個突變體D93C/F96C和K153C/S251C，結合實驗確認了其熱穩定性增強，且熱穩定性變化與二級結構、表面電荷和分子間作用力的變化有關。郇佳欣等對脂肪酶A進行固定化處理后，制得的ANL@Zn-MOF在25～75 ℃的溫度范圍內表現出優于ANL處理組的OTA降解能力。在45 ℃時，ANL@Zn-MOF的OTA降解率達到73%，而ANL的降解率僅為40%。

與耐熱性改造類似，OTA解毒酶的耐酸性改造也對適應工業化生產有重要意義。存在OTA污染的食品或飼料的pH值主要為酸性，尤其是葡萄酒葡萄汁等產品的pH值范圍為2.8～3.8。影響酶耐酸性的關鍵因素包括催化殘基的pKa值、酶表面的凈電荷特性以及耐酸酶的分子結構特征等。Xiong Lu等研究得到的M-CPA和S-CPA最適pH值均為8.0，但是M-CPA在pH 3～11條件下酶活力均優于S-CPA。張真真利用降低表面凈電荷、降低催化殘基E270的pKa值和分子動力學模擬等理性設計策略，結合實驗篩選得到4 個耐酸性提高的突變體，其中，突變體L203H的催化效率（Kcat/Km）相較于野生型提高82.60%，在pH 6.0的條件下，對OTA的降解率達到98.76%，其耐酸性提高的原因為E270在酸性條件下的質子化狀態得到穩定，使其仍能保持活性形式并發揮催化作用。

3 結語

自1969年首次鑒定出具備OTA降解活性的CPA[32]以來，OTA降解酶的研究已歷經50余年。包括CPA與ADH在內的多類水解酶在OTA的生物脫毒過程中展現出重要的作用。隨著蛋白質結構解析和作用機制研究的深入，相關酶類的催化特性及底物識別模式已被系統闡明，同時也為其他真菌毒素降解酶的開發提供了理論基礎與技術路徑。在酶的工業化制備方面，已有研究從基因設計、表達系統或載體選擇、表達優化及酶的理性設計等層面對表達量和酶學性能進行調控，特別是在提升酶的耐熱性和耐酸性方面取得初步進展。然而，相較其他類型酶及真菌毒素降解研究，OTA降解酶的功能優化與工程應用仍處于相對初期階段，其規模化生產和實際應用受限于政策監管與標準體系等因素，亟需在催化機制解析、性能提升及應用拓展等方面持續深化研究。

未來研究亟需在酶的表達水平、催化活性及應用范圍拓展等方面持續深入，以推動OTA降解酶在基礎研究與實際應用中的發展。基于此，本文提出以下若干值得關注的研究方向，以期為該領域的持續推進提供參考：1）酶資源獲取：以靶向環境、已有蛋白質或酶數據庫為目標，利用計算機模擬篩選、機器學習等手段進行高通量篩選，以期挖掘性能更加優異的OTA降解酶。2）酶的表達量與酶特性優化：依托基因密碼子優化、啟動子篩選、表達載體工程及發酵參數調控等手段，實現高效、可持續的酶制備；通過蛋白質工程、理性設計、定向進化與分子動力學模擬等手段，提升酶的耐熱性、耐酸堿性、耐鹽性與底物特異性，以滿足工業化應用需求；將酶降解技術與固定化技術和納米載體系統結合，推動其在食品加工、飼料添加劑等多元化場景下的精準應用。3）構建相關行業標準與政策路徑：加強OTA降解酶相關產品的注冊管理、毒理評估與功能驗證，推動制定統一的產業規范和質量控制標準；加快酶制劑在綠色農業、無公害食品體系中的準入程序進程，從源頭推動其在全球農業與食品安全體系中的融合與應用。

引文格式：

牛澤慧, 梁志宏. 赭曲霉毒素A降解酶研究進展[J]. 食品科學, 2025, 46(20): 370-382. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250216-060.

NIU Zehui, LIANG Zhihong. Current advances in ochratoxin A-degrading enzymes[J]. Food Science, 2025, 46(20):370-382. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250216-060.

實習編輯：楊瓊；責任編輯：張睿梅。點擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網

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