Life?Metabolism?|?John R Speakman團隊發現短期熱量限制激活跨組織選擇性剪接程序，揭示抗衰新機制

衰老是多種慢性疾病（如2型糖尿病、神經退行性疾病、心血管疾病和癌癥等）的主要風險因素。熱量限制（Calorie Restriction, CR）作為一種非遺傳干預手段，已被廣泛證實能夠延緩衰老過程，延長健康壽命，但其分子機制尚未完全闡明。選擇性剪接（Alternative Splicing, AS）作為轉錄后調控的關鍵環節，在衰老過程中出現失調，但在CR后這種失調有所減輕，這表明AS在CR的有益效應中起著重要作用。但CR引發的AS響應是否具有組織特異性，以及AS響應是否與CR水平成比例仍不甚清楚。這個問題的解決可能解釋CR的系統性抗衰老效應。

近日，John R. Speakman研究團隊在Life Metabolism期刊發表題為A functionally integrated cross-tissue alternative splicingprogram during short-term calorie restriction的研究論文，通過整合既往小鼠多組織RNA-seq資源，并新增肌肉與睪丸測序數據，構建了六組織梯度CR轉錄組用于系統性剪接分析，系統描繪了短期CR引發的AS圖譜，提出“位點組織特異、功能跨組織整合”的剪接響應框架，為理解CR的抗衰老作用提供了新視角。

該研究利用48只雄性C57BL/6小鼠模型進行為期3個月的梯度CR（0%-40%，以10%遞增），并設置12小時自由進食對照組（12AL），隨后采集6種組織（包括白色脂肪組織（eWAT）、肝臟、下丘腦、肌肉、睪丸和胃）的RNA-seq數據。通過比較CR組與12小時自由進食對照組（12AL），系統分析了基因表達和AS的變化。

研究首先分析了全轉錄組基因表達對梯度CR的響應。結果顯示，除睪丸和下丘腦外，其他組織的差異表達基因（differentially expressed genes, DEGs）數量隨CR水平升高而增加。其中，eWAT的DEGs最多（4126個），其次是肌肉（1982個）和肝臟（1883個），而睪丸、下丘腦和胃的響應較弱。這些趨勢通過差異基因表達分析可視化，提示短期CR對代謝活躍的外周組織（脂肪、骨骼肌、肝臟）的轉錄重塑更為顯著。

值得注意的是，40% CR時僅有兩個基因（H2-Aa和H2-Eb1，均為MHC II相關基因）在所有6種組織中呈現一致性的表達下調，這提示CR可能通過抑制年齡相關的炎癥/免疫通路發揮益處。進一步轉錄因子富集分析表明，CR調控了脂質代謝、氧化應激和免疫相關通路，且這些響應具有組織特異性。例如，PPAR-α靶基因在肌肉、睪丸、肝臟和eWAT中上調，而炎癥相關轉錄因子（如Jun和SMAD家族）在eWAT中顯著下調。

剪接調節因子（splicing regulators, SRs）負責調控AS過程，通過結合pre-mRNA的特定順式作用元件（如外顯子增強子或沉默子），調控剪接體的組裝和剪接位點的選擇，影響基因表達。SRs表達分析顯示，SRs差異表達數量隨CR程度升高而增加，且主要集中在肌肉、eWAT和肝臟，其中少數SRs呈跨組織一致變化，例如冷誘導RNA結合蛋白Rbm3在4種組織上調，提示CR可能通過影響體溫/應激相關通路，啟動更廣泛的剪接重塑。

AS分析是本文的核心。研究發現CR導致的差異剪接（differential AS, DAS）和差異轉錄本使用（differential transcript usage, DTU）事件隨CR程度升高而顯著增加。肌肉、eWAT和肝臟的AS響應最為顯著；值得注意的是，睪丸盡管基因表達變化較小，卻表現出強烈的AS響應，提示AS在睪丸中可能具有獨特作用。重要的是，94%的DAS基因位點并不伴隨基因層面的差異表達，表明AS在很大程度上是獨立于轉錄調控的CR響應機制。DAS和DTU分析進一步量化了這些變化，顯示各組織在不同CR水平下的異構體使用模式。然而，DAS與DEGs的重疊程度高于隨機預期，提示轉錄與轉錄后過程存在協同調控。功能富集分析顯示，不同組織中被AS重塑的具體位點差異很大，但富集的生物過程高度一致，主要指向線粒體功能與氧化磷酸化、轉錄翻譯、RNA和蛋白質質量控制以及細胞死亡/自噬等衰老相關環節等過程，這些功能在多個組織中共享，體現了AS響應的功能整合性。

盡管AS響應以組織特異性為主，但研究仍然鑒定出一組跨組織共享的AS位點，這些位點可能介導CR的系統性效應。例如，Gna13與Nfe2l2在多組織中呈現轉錄本切換，分別關聯GPCR信號與抗氧化/應激調控。此外，參與內體分選與細胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）生物發生的Pdcd6ip與Arrdc4也出現跨組織剪接變化，提示CR可能通過“剪接—囊泡—細胞間通訊”軸影響衰老相關表型。這些共享位點提示CR可能通過調控細胞間通訊延緩衰老，為后續機制研究提供了靶點。

該研究的發現支持了“AS失調是衰老標志之一，而CR可逆轉這一過程”的假設。AS響應與CR水平的劑量依賴性關系，暗示AS是CR改善健康壽命的關鍵介質。尤其值得注意的是，SRs的表達變化與AS響應一致，如冷誘導蛋白Rbm3在四個組織中上調，可能與CR相關的體溫下降機制聯動。需要強調的是，這項研究尚未進行功能性的因果性驗證。同時，作者也提出若干技術與設計局限，如測序讀長與深度在不同組織間不一致，樣本量相對有限，且僅使用雄性小鼠并采用3個月短期CR。未來可采用長讀長測序或事件級AS分析提高異構體分辨率，同時納入雌性與更長期的CR模型，以及圍繞跨組織共享位點（如Gna13、Nfe2l2、EV相關基因）開展遺傳、藥理學干預以檢驗其對健康壽命指標的因果貢獻。

綜上所述，該研究系統描繪了短期CR誘導的AS圖譜，強調AS作為獨立于基因表達的抗衰老機制，通過整合多組織數據，揭示了AS在代謝重塑、蛋白質穩態和細胞通訊中的核心作用，為開發模擬CR效應的藥物提供了新靶點。

原文：https://doi.org/10.1093/lifemeta/loaf046

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