J Ethnopharmacol I 他克莫司腎毒性如何破解？

2026年1月13日，海軍軍醫(yī)大學(xué)（第二軍醫(yī)大學(xué)）第二附屬醫(yī)院（上海長(zhǎng)征醫(yī)院）藥學(xué)部陳萬(wàn)生、陶霞、張鳳教授團(tuán)隊(duì)在Journal of Ethnopharmacology (IF=5.4，中科院2區(qū)，Q1)在線發(fā)表題為“Integrated metabolomics and proteomics analysis elucidated the therapeutic effect of Huangkui Capsule on tacrolimus-induced chronic nephrotoxicity in rats”（整合代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析闡明了黃葵膠囊對(duì)大鼠他克莫司誘導(dǎo)的慢性腎毒性的治療作用）的研究論文。

海軍軍醫(yī)大學(xué)（第二軍醫(yī)大學(xué)）長(zhǎng)征醫(yī)院藥學(xué)部龐濤主管藥師、博士研究生唐婷婷、碩士研究生王業(yè)健為本論文共同第一作者。

亮點(diǎn)：

?HK 可減輕體內(nèi)他克莫司引起的慢性腎毒性和體外他克莫司引起的細(xì)胞毒性。

?HK 通過(guò)激活 xCT/Gpx4 通路抑制鐵死亡，從而對(duì)抗 TCN。

?來(lái)自HK的槲皮素、槲皮素-7-O-β-葡糖醛酸苷和檉柳素可通過(guò)上調(diào)Slc7a11/Slc3a2系統(tǒng)來(lái)增強(qiáng)GSH合成并抑制脂質(zhì)過(guò)氧化。

民族藥理學(xué)相關(guān)性

黃葵膠囊（HK）在治療慢性腎臟病方面已顯示出顯著療效。既往研究表明，HK可以減輕腎臟損傷；然而，HK對(duì)他克莫司誘導(dǎo)的慢性腎毒性（TCN）的治療作用及其潛在的分子機(jī)制尚不明確。

研究目的

評(píng)價(jià)HK在緩解TCN方面的有效性，并探索其潛在的作用機(jī)制。

材料與方法

本研究采用生化指標(biāo)和組織病理學(xué)檢查，在TCN大鼠模型上評(píng)價(jià)了HK的治療效果。通過(guò)整合腎臟代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析，揭示了TCN相關(guān)的獨(dú)特失調(diào)通路和潛在靶點(diǎn)，并深入探討了靶點(diǎn)與HK活性成分之間的關(guān)系。此外，還利用分子對(duì)接和Western blot分析對(duì)結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。

結(jié)果

TCN大鼠表現(xiàn)出蛋白尿增加和腎功能惡化，并伴有炎癥和氧化應(yīng)激增強(qiáng)，而HK則以劑量依賴的方式改善腎損傷。整合代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明，HK通過(guò)恢復(fù)谷胱甘肽代謝和上調(diào)Gclc、Gclm、Slc7a11、Slc3a2和Gpx4來(lái)抑制TCN，并通過(guò)構(gòu)建的“蛋白質(zhì)-通路-代謝物”網(wǎng)絡(luò)分析揭示了鐵死亡的特異性調(diào)控機(jī)制。機(jī)制上，他克莫司干預(yù)增加了細(xì)胞內(nèi)Fe2?水平，通過(guò)下調(diào)Slc7a11和Slc3a2抑制了xCT系統(tǒng)活性，并降低了Gpx4水平，從而增加了鐵死亡的易感性。來(lái)自 HK 的 Tamarixetin 和槲皮素-7-O-β-葡糖醛酸苷可以逆轉(zhuǎn)這些影響，恢復(fù) Slc7a11、Slc3a2 和 Gpx4 的表達(dá)水平，表現(xiàn)出與 Fer-1 相當(dāng)?shù)男Ч?/p>

結(jié)論

代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)綜合分析表明，HK通過(guò)抑制鐵死亡來(lái)減輕TCN。這種保護(hù)作用是由其生物活性成分介導(dǎo)的，特別是槲皮素、檉柳素和槲皮素-7-O-β-葡糖醛酸苷，它們通過(guò)上調(diào)Slc7a11/Slc3a2系統(tǒng)來(lái)增強(qiáng)GSH合成并抑制脂質(zhì)過(guò)氧化。

01

研究背景及科學(xué)問(wèn)題

他克莫司是一種具有強(qiáng)效免疫抑制作用的鈣調(diào)磷酸酶抑制劑，已被廣泛確立為腎移植受者一線治療藥物，用于減輕移植物排斥反應(yīng)（Ong和Gaston，2021）。其長(zhǎng)期腎毒性（TCN）是一個(gè)重要的臨床挑戰(zhàn)，即使他克莫司谷濃度維持在治療范圍內(nèi)（5-8 ng/mL），仍有約20%的患者會(huì)出現(xiàn)TCN（Wojciechowski和Wiseman，2021；van Gelder等，2014；Kosoku等，2022）。TCN的早期表現(xiàn)通常包括腎功能受損和蛋白尿，這兩者都被認(rèn)為是導(dǎo)致慢性移植物功能障礙的主要因素（Bentata，2020）。臨床證據(jù)表明，對(duì)血清和/或尿液樣本中特定代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)特征進(jìn)行定量分析，能夠鑒別診斷腎功能損害，從而將這些分子特征確定為早期腎病檢測(cè)的潛在生物標(biāo)志物（Guo et al., 2019;Medyńska et al., 2024）。目前，TCN的治療選擇仍然有限，主要干預(yù)措施是降低劑量或停藥。由此產(chǎn)生的臨床困境凸顯了開發(fā)安全有效的TCN治療策略并保護(hù)患者長(zhǎng)期健康的迫切性。

黃葵（Abelmoschus manihot(L.) Medic.）是錦葵科的一種植物，因其富含黃酮類化合物而具有藥理學(xué)價(jià)值。其主要生物活性成分包括槲皮素、檉柳素、山奈酚及其衍生物（Wei et al., 2023）。在中國(guó)，黃秋葵在慢性腎臟病（CKD）的治療中有著悠久的傳統(tǒng)應(yīng)用歷史（Luan et al., 2020;Li et al., 2021b;Chen et al., 2025）。黃秋葵的乙醇提取物制成黃葵膠囊（HK），具有顯著的腎臟保護(hù)作用（Zhang et al., 2014;Yan et al., 2025）。其治療CKD的作用機(jī)制涉及多種途徑，包括抗炎和抗氧化途徑。己酮可可堿（HK）因其抗炎作用而聞名，其作用機(jī)制是通過(guò)阻斷炎癥通路和降低炎癥標(biāo)志物（Yan et al., 2025）。同時(shí)，HK還能通過(guò)增強(qiáng)抗氧化酶（如超氧化物歧化酶（SOD））的活性，并降低丙二醛（MDA）等毒性代謝物的水平來(lái)減輕氧化應(yīng)激，從而減輕腎小管損傷（Li et al., 2021b）。此外，HK還能通過(guò)抑制免疫復(fù)合物的積累來(lái)重塑腎臟免疫微環(huán)境。這種重塑作用可以保護(hù)腎小球?yàn)V過(guò)屏障并減少尿蛋白漏（Wei et al., 2023）。臨床上，HK單藥治療及其與標(biāo)準(zhǔn)腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)抑制劑聯(lián)合治療均已證實(shí)對(duì)慢性腎臟病（CKD）具有良好的療效。研究證實(shí)，這些治療方法能有效維持腎功能的長(zhǎng)期穩(wěn)定，延緩終末期腎病的進(jìn)展，且不良事件發(fā)生率始終較低（Zhang et al, 2014;Yan et al, 2025）。此外，HK還能有效改善腎移植后患者的蛋白尿并降低炎癥因子水平（Yao et al, 2025;Xing et al., 2019;Wu et al., 2024）。盡管近年來(lái)HK的臨床和基礎(chǔ)研究不斷增加，但其在TCN中的具體腎臟保護(hù)作用仍有待明確。此外，HK發(fā)揮抗TCN保護(hù)作用的完整分子機(jī)制和信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)也尚未完全闡明。

代謝組學(xué)是一種通過(guò)分析小分子代謝物來(lái)表征病理狀態(tài)的寶貴工具。它已被廣泛用于闡明藥物不良反應(yīng)通路，并日益融入毒理學(xué)研究和安全性藥理學(xué)評(píng)價(jià)中（Guo et al., 2022;Lim et al., 2023）。同樣，蛋白質(zhì)組學(xué)也已成為另一種強(qiáng)大的系統(tǒng)生物學(xué)工具，用于識(shí)別與毒性相關(guān)的蛋白質(zhì)組學(xué)改變，同時(shí)闡明其潛在的機(jī)制網(wǎng)絡(luò)（Deng et al., 2024;Fartade et al., 2025）。通過(guò)整合代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，我們可以系統(tǒng)地分析細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)和疾病機(jī)制，從而顯著增強(qiáng)我們對(duì)生物通路如何響應(yīng)擾動(dòng)的理解（Canzler et al., 2020;Dubin and Rhee, 2020;Hussain and Kingsley, 2025）。這種聯(lián)合組學(xué)方法已在我們之前的研究中得到有效應(yīng)用，用于闡明化療引起的副作用的潛在機(jī)制并確定治療策略（Li et al., 2021a;Yao et al., 2022）。

迄今為止，代謝組學(xué)已成為闡明HK對(duì)糖尿病腎病和順鉑誘導(dǎo)的腎損傷的腎臟保護(hù)機(jī)制的關(guān)鍵工具（Yan et al., 2025;Han et al., 2025;Liao et al., 2025）。代謝組學(xué)分析表明，HK可通過(guò)調(diào)節(jié)鞘脂和視黃醇代謝等代謝物來(lái)改善腎功能障礙。借助質(zhì)譜成像分析進(jìn)行化合物鑒定或16S rRNA測(cè)序，研究人員還鑒定了核心治療靶點(diǎn)和藥物活性成分。這些研究為HK治療腎臟疾病的機(jī)制驗(yàn)證提供了寶貴的思路和整體框架。

在本研究中，我們建立了大鼠TCN模型，并采用腎臟代謝組學(xué)分析系統(tǒng)地定量分析了HK治療后內(nèi)源性代謝物的變化，從而闡明了與TCN病理生理相關(guān)的生化通路紊亂。同時(shí)，我們通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)分析鑒定了與TCN發(fā)病機(jī)制相關(guān)的潛在治療靶點(diǎn)。隨后，我們利用他克莫司誘導(dǎo)的腎損傷體外模型和分子對(duì)接技術(shù)驗(yàn)證了HK類黃酮與這些靶點(diǎn)的相互作用。綜上所述，這一綜合策略闡明了HK對(duì)TCN的保護(hù)機(jī)制，為其治療潛力提供了新的分子層面的見解，并為未來(lái)HK介導(dǎo)的腎損傷代謝調(diào)控研究奠定了基礎(chǔ)。

02

重要發(fā)現(xiàn)及亮點(diǎn)

3.1 . HK治療顯著緩解了大鼠的TCN癥狀并改善了腎功能。

與正常組（NOR組）相比，中毒組（MOD組）大鼠的體重增加顯著降低（57.84 ± 16.27 g vs. 110.40 ± 3.71 g）（p< 0.001，圖S1）。HK治療逆轉(zhuǎn)了這一趨勢(shì)，其中HK-H組（2.8 g/kg/天）的恢復(fù)最為顯著。同時(shí)，與正常組相比，中毒組的血清肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、尿肌酐（Ucr）和24小時(shí)尿蛋白（24-h UProt）水平顯著升高（p< 0.001）。低劑量、中劑量和高劑量HK（HK-L、HK-M和HK-H）治療均顯著降低了這些指標(biāo)，且呈明顯的劑量依賴性。值得注意的是，HK-H組的血清肌酐、尿素氮、尿素氮和24小時(shí)尿蛋白水平顯著低于正常組（圖1A-D）。組織學(xué)分析（H&E染色和Masson染色）顯示，MOD組腎小管管腔擴(kuò)張、腎小球萎縮、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、大量藍(lán)染膠原纖維以及明顯的間質(zhì)纖維增生，表明他克莫司誘導(dǎo)了明顯的腎損傷。相比之下，所有HK治療組的腎損傷均有不同程度的減輕，證實(shí)了HK對(duì)他克莫司腎病（TCN）的保護(hù)作用（圖1E）。

圖 1.HK可顯著改善由他克莫司引起的慢性腎損傷導(dǎo)致的腎功能退化和腎組織病理?yè)p傷。

（AD）血清肌酐（Scr）、尿肌酐（Ucr）、血尿素氮（BUN）和24小時(shí)尿蛋白水平（n=8）。（E）蘇木精-伊紅（H&E）染色和Masson染色（×200）。（F）TUNEL染色（×40）。（GI）腎小球髓鞘形成蛋白-1（KIM-1）、中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白（NGAL）和8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）水平（n=8）。（JN）腎臟中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）、I型膠原、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）和caspase-3的蛋白表達(dá)（n=3）。###與正常組（NOR ）相比，p < 0.001；* 與中度偏頭痛組（MOD）相比，p< 0.05，** 與中度偏頭痛組（MOD）相比，p< 0.01，***與中度偏頭痛組（MOD）相比，p < 0.001。

3.2 . HK減輕了TCN大鼠腎組織細(xì)胞的凋亡，降低了腎損傷標(biāo)志物水平和腎纖維化程度。

TUNEL染色結(jié)果顯示，MOD組細(xì)胞凋亡顯著增加，而HK-L、HK-M和HK-H治療可顯著降低細(xì)胞凋亡（圖1F）。與此一致，HK給藥后尿液中KIM-1、NGAL和8-OHdG的水平顯著降低（圖1G-I）（p< 0.01，p< 0.001）。高劑量HK使KIM-1從22.55 ± 3.2 pg/mL降至13.42 ± 2.10 pg/mL，NGAL從33.59 ± 1.09 ng/mL降至20.35 ± 1.41 ng/mL，8-OHdG從29.16 ± 2.25 ng/mL降至16.95 ± 2.31 ng/mL（p< 0.001）。 Western blotting進(jìn)一步證實(shí)，與NOR組相比，他克莫司上調(diào)了MOD組中纖維化標(biāo)志物（TGF-β1、膠原蛋白1和α-SMA）和凋亡標(biāo)志物caspase-3的表達(dá)（p< 0.001）。HK治療表現(xiàn)出這些蛋白的劑量依賴性降低，有效改善了腎纖維化（圖1J-N）。

3.3 . HK改善了TCN大鼠的腎臟代謝紊亂

代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的PCA分析表明，在正負(fù)離子模式下，質(zhì)控樣品均呈現(xiàn)緊密聚類，證實(shí)了分析流程的可靠性（圖S2A-H）。PCA模型（圖2A和2B）顯示出清晰的組間分離，HK處理組的代謝譜向NOR組偏移。這一趨勢(shì)表明，HK處理后他克莫司誘導(dǎo)的代謝功能障礙得到逆轉(zhuǎn)。OPLS-DA進(jìn)一步驗(yàn)證了這種分離，在NOR組和MOD組之間以及MOD組和HK-H組之間觀察到了明顯的聚類（圖2C和2D）。代謝物鑒定后，分別從NOR組與MOD組以及MOD組與HK-H組的比較中鑒定出106種和125種差異代謝物（圖2E）。隨后的維恩圖分析鑒定出80種在兩組比較中均存在的差異代謝物（圖2F）。表S1總結(jié)了NOR組、MOD組和HK-H組中80種差異代謝物的變化。對(duì)這些代謝物進(jìn)行KEGG通路富集分析，結(jié)果顯示33條通路顯著富集。關(guān)鍵的顯著富集通路（Impact > 0.1，p< 0.05）包括谷胱甘肽代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、牛磺酸和亞牛磺酸代謝以及精氨酸生物合成（圖2H）。在這些通路中鑒定出9種關(guān)鍵差異代謝物：L-脯氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-精氨酸、γ-谷氨酰半胱氨酸、焦谷氨酸、肌酸、谷胱甘肽和牛磺酸（圖2I）。這些代謝物在NOR組、MOD組和HK-H組之間均表現(xiàn)出顯著變化。同樣，我們也分析了NOR組、MOD組和HK-L組或HK-M組之間的代謝譜變化。 OPLS模型清晰地展示了HK-L組（圖S3A和B）和HK-M組（圖S3C和D）與MOD組相比的代謝譜差異。差異代謝物篩選后，分別在HK-L組和HK-M組中鑒定出60種和62種差異代謝物（表S2和S3）。后續(xù)的KEGG通路富集分析表明，HK-L組和HK-M組中的差異表達(dá)代謝物顯著富集于四個(gè)共同通路：谷胱甘肽代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、牛磺酸和亞牛磺酸代謝以及精氨酸生物合成（影響值>0.1，p<0.05，圖S3B和D）。值得注意的是，這種富集模式與HK-H組的觀察結(jié)果高度一致，表明HK治療范圍內(nèi)代謝反應(yīng)具有一致性。

圖 2.非靶向腎臟代謝組學(xué)分析。

（A）正離子模式和（B）負(fù)離子模式下所有組的PCA二維得分圖；（C，D）正負(fù)離子模式下兩組之間的OPLS-DA二維得分圖和置換檢驗(yàn)結(jié)果；（E）兩組之間上調(diào)和下調(diào)的代謝物；（F）差異代謝物的維恩圖；（G）80個(gè)差異代謝物的熱圖；（H）差異代謝物通路圖；（I）關(guān)鍵通路中9個(gè)差異代謝物的熱圖。

3.4 . HK對(duì)TCN大鼠腎臟緩解作用的蛋白質(zhì)組學(xué)特征分析

質(zhì)量控制分析證實(shí)了蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的可靠性（圖S4A-D）。在NOR組和MOD組之間共鑒定出364個(gè)差異表達(dá)蛋白（DEPs）（|log2 FC| > 1，p < 0.05），其中154個(gè)上調(diào)，210個(gè)下調(diào)（圖3A）。同樣，在MOD組和HK-H組之間鑒定出145個(gè)DEPs，其中64個(gè)上調(diào)，81個(gè)下調(diào)（圖3B）。熱圖可視化了DEPs的表達(dá)模式，而維恩圖則展示了兩個(gè)比較中共有的112個(gè)蛋白（圖3C和D）。基因本體（GO）富集分析揭示了各組之間不同的分子特征（圖3E）。具體而言，DEPs主要參與細(xì)胞氨基酸分解代謝和谷胱甘肽代謝等生物學(xué)過(guò)程。這些分子功能包括抗氧化/氧化還原酶、谷氨酸-半胱氨酸連接酶和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性。細(xì)胞成分包括細(xì)胞外囊泡和線粒體基質(zhì)。KEGG通路分析顯示，差異表達(dá)蛋白富集于十條通路（p< 0.05），包括鐵死亡、谷胱甘肽代謝以及蛋白質(zhì)消化吸收（圖3F，表S4）。隨后，將這些通路中富集的24個(gè)蛋白組成一個(gè)關(guān)鍵蛋白簇，用于后續(xù)的整合分析。

圖 3.MOD組的腎臟蛋白質(zhì)組學(xué)特征與 NOR 組或 HK-H 組不同。

火山圖：（A）NOR vs. MOD 和（B）MOD vs. HK-H；（C）差異蛋白的維恩圖；（D）GO 功能分析結(jié)果；（E）差異蛋白的熱圖；（F）KEGG 通路的桑基圖；（G）顯著差異代謝物與蛋白相關(guān)性分析的熱圖；（H）蛋白-KEGG 通路-代謝物關(guān)聯(lián)圖，篩選出 7 條主要通路；（I）5 個(gè)關(guān)鍵蛋白和（J）3 個(gè)關(guān)鍵代謝物的表達(dá)水平變化；#p<0.001，###p<0.001 vs NOR 組；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001 vs MOD 組。

3.5 .綜合代謝和原生質(zhì)分析

相關(guān)性分析鑒定出7種關(guān)鍵差異代謝物，包括肌酸、谷胱甘肽、L-精氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸和牛磺酸，以及19種關(guān)鍵差異蛋白，包括Aadat、C1qb、Cndp1、Ddo、Folh1、Gclc、Gclm、Gpx1、Gpx4、Hnmt、Mep1a、Mme、Mrc2、Slc3a2、Slc6a19、Slc7a11、Tap1、Tubb6和Xpnpep2，這些蛋白與TCN的病理生理學(xué)相關(guān)（圖3G，表1）。通路富集分析表明，多個(gè)關(guān)鍵過(guò)程存在顯著失調(diào)，包括鐵死亡、蛋白質(zhì)消化吸收以及與谷胱甘肽、組氨酸和氨基酸相關(guān)的多種代謝通路。進(jìn)一步構(gòu)建的“蛋白質(zhì)-通路-代謝物”網(wǎng)絡(luò)分析表明，HK 通過(guò)增強(qiáng)谷胱甘肽合成來(lái)抑制鐵死亡，從而減弱 TCN（圖 3H-J）。

3.6 . HK抑制TCN中氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的鐵死亡

與NOR組相比，MOD組的抗氧化標(biāo)志物水平顯著降低，包括GSH、SOD和CAT。相反，脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA、鐵死亡相關(guān)標(biāo)志物Fe2?以及DHE熒光（ROS的指標(biāo)）的水平顯著升高（p< 0.001）。HK治療呈劑量依賴性地減輕了這些改變，表現(xiàn)為GSH、SOD和CAT水平的恢復(fù)，以及MDA、Fe2?和DHE熒光水平的降低（圖4A-F），其中HK-H組的效果最為顯著。同時(shí)，Western blot分析顯示，MOD組大鼠腎組織中關(guān)鍵鐵死亡調(diào)節(jié)因子（Slc7a11、Gpx4、Slc3a2）的蛋白表達(dá)顯著下調(diào)。 HK 治療可劑量依賴性地逆轉(zhuǎn)這種下調(diào)（p< 0.05，p< 0.01，p< 0.001），HK-H 組可顯著地將 Slc7a11 和 Gpx4 的表達(dá)恢復(fù)到接近正常水平（p< 0.001）（圖 4G-J）。

圖 4.腎臟組織中鐵死亡和谷胱甘肽代謝相關(guān)標(biāo)志物。

（AE）SOD、MDA、Fe2+、CAT 和 GSH 水平（n=8）；（F）ROS 表達(dá)水平（×40）（n=3）；（G）谷胱甘肽代謝和鐵死亡關(guān)鍵蛋白條帶的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果；（HJ）Gpx4、Slc3a2 和 Slc7a11 的表達(dá)結(jié)果；###p<0.001 vs NOR 組；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001 vs MOD 組。

3.7 . HK類黃酮抑制他克莫司誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷中氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的鐵死亡

我們采用先前研究（ Zhang et al., 2025）中建立的方法鑒定了六種HK類黃酮，并據(jù)此進(jìn)行了重新分析（圖S5和S6，表S5）。它們對(duì)HK-2細(xì)胞活力的影響如圖S7所示。他克莫司處理顯著降低了HK-2細(xì)胞的活力，而六種黃酮類化合物中的任何一種都能減輕這種降低，其程度與陽(yáng)性對(duì)照Fer-1相當(dāng)（圖5A，p< 0.001）。此外，他克莫司在HK-2細(xì)胞中誘導(dǎo)了顯著的氧化應(yīng)激反應(yīng)，表現(xiàn)為MDA水平升高、GSH水平降低以及SOD和CAT活性降低（p< 0.001）。Fer-1的聯(lián)合給藥證實(shí)了鐵死亡的參與，F(xiàn)er-1能有效逆轉(zhuǎn)這些生化改變。對(duì)HK類黃酮的比較評(píng)估發(fā)現(xiàn)，槲皮素、檉柳素和槲皮素-7-O-β-葡糖醛酸苷是鐵死亡最有效的抑制劑，因?yàn)樗鼈冿@著地使所有四種氧化應(yīng)激標(biāo)志物的水平恢復(fù)正常。山奈酚-3-O-β-D-葡糖醛酸苷和米奎利寧也能降低MDA水平并提高GSH水平，但它們對(duì)SOD和CAT活性的影響較小（圖5B-E）。此外，F(xiàn)er-1、槲皮素、檉柳素、槲皮素-7-O-β-葡糖醛酸苷和山奈酚-3-O-β-D-葡糖醛酸苷均能顯著減弱他克莫司誘導(dǎo)的Fe2?積累（圖5F）。透射電鏡提供了鐵死亡的超微結(jié)構(gòu)證據(jù)，表明他克莫司導(dǎo)致嚴(yán)重的線粒體損傷，包括線粒體斷裂、外膜破裂和嵴丟失。與Fer-1或黃酮類化合物聯(lián)合治療可顯著改善這些形態(tài)學(xué)缺陷，其中槲皮素、檉柳素和槲皮素-7-O-β-葡糖醛酸苷的保護(hù)作用最為顯著（圖5G）。

圖 5.他克莫司誘導(dǎo)的 HK-2 損傷細(xì)胞中鐵死亡相關(guān)標(biāo)志物以及 HK 黃酮類化合物和 Fer-1 的發(fā)現(xiàn)。

(A) 細(xì)胞活力； (BF) SOD、MDA、CAT、GSH 和 Fe2+水平； (G)透射電子顯微鏡(×8000)； TAC，他克莫司；闕，槲皮素； Tam，檉柳西汀； Iso，異鼠李素； Que-7-Glu、槲皮素-7-O-β-葡萄糖苷酸； Kae-D-Glu、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷酸； Miq，米奎寧。###與 NOR 組相比，p<0.001；與 MOD 組相比， *p<0.05，***p<0.001。

3.8分子對(duì)接分析和分子動(dòng)力學(xué)模擬

六種HK類黃酮與Slc7a11（圖6A）和Slc3a2（圖6B）表現(xiàn)出很強(qiáng)的結(jié)合親和力，結(jié)合能低于-7.0 kcal/mol。其中三種黃酮的親和力最高：槲皮素與Slc7a11的結(jié)合能為-9.1 kcal/mol，與Slc3a2的結(jié)合能為-7.9 kcal/mol；檉柳素與Slc7a11的結(jié)合能為-9.2 kcal/mol，與Slc3a2的結(jié)合能為-7.9 kcal/mol；槲皮素-7-O-β-葡糖醛酸苷與Slc7a11的結(jié)合能為-9.5 kcal/mol，與Slc3a2的結(jié)合能為-8.7 kcal/mol（表2）。分子動(dòng)力學(xué)模擬（模擬時(shí)間超過(guò)100納秒）表明，三種黃酮類化合物與Slc7a11（圖6C）和Slc3a2（圖6D）均能穩(wěn)定結(jié)合，這體現(xiàn)在其較低的RMSD和RMSF值上。在這些黃酮類化合物中，槲皮素-7-O-β-葡糖醛酸苷與這兩種蛋白形成的復(fù)合物最為穩(wěn)定。

圖 6.分子對(duì)接模擬和分子動(dòng)力學(xué)模擬。

槲皮素、檉柳黃素、異鼠李素、槲皮素-7-O-β-葡萄糖苷酸、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷酸和米奎寧與(A) Slc7a11和(B) Slc3a2結(jié)合； (C) Slc7a11 和 (D) Slc3a2 的 RMSD 圖表。 TAC，他克莫司；闕，槲皮素； Tam，檉柳西汀； Iso，異鼠李素； Que-7-Glu、槲皮素-7-O-β-葡萄糖苷酸； Kae-D-Glu、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷酸； Miq，米奎寧。

表2.化合物-蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)合親和力

3.9 . HK通過(guò)xCT/GPX-4信號(hào)通路抑制鐵死亡

在HK-2細(xì)胞中，他克莫司暴露顯著抑制了Gpx4、Slc7a11和Slc3a2的表達(dá)水平（p< 0.001）。槲皮素、槲皮素-7-O-β-葡糖醛酸苷、檉柳素和山奈酚-3-O-β-D-葡糖醛酸苷均能有效逆轉(zhuǎn)這種抑制作用（圖7A-D）。這些結(jié)果證實(shí)，HK及其活性成分在體內(nèi)外均能通過(guò)xCT/Gpx4信號(hào)通路拮抗他克莫司誘導(dǎo)的鐵死亡。

圖7.類黃酮影響HK-2 細(xì)胞中 Slc7a11、Gpx4 和 Slc3a2 的蛋白表達(dá)水平。(A) 蛋白質(zhì)條帶； (B)Slc7a11； (C)GPX4； (D)Slc3a2。 TAC，他克莫司；闕，槲皮素； Tam，檉柳西汀； Iso，異鼠李素； Que-7-Glu、槲皮素-7-O-β-葡萄糖苷酸； Kae-D-Glu、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷酸； Miq，米奎寧。###與 NOR 組相比，p<0.001；與 MOD 組相比，*p<0.05，**p<0.01，***p <0.001。

【Citation】Pang T, Tang T, Wang Y, Li J, Yang L, He Y, Yang H, Han J, Tao X, Chen W, Zhang F. Integrated metabolomics and proteomics analysis elucidated the therapeutic effect of Huangkuui Capsule on tacrolimus-induced chronic nephrotoxicity in rats.Journal of Ethnopharmacology.2026.1.13.