Autophagy. | 小核糖核酸病毒 VP2 蛋白通過選擇性自噬降解 IKBKE/IKKε 抑制先天免疫

由蘭州大學 / 中國農業科學院蘭州獸醫研究所鄭海學研究員、楊帆研究員和朱紫祥研究員為通訊作者2025 年 12 月在 Autophagy 上發表了題為 “Picornavirus VP2 protein suppresses innate immunity through selective autophagic degradation of IKBKE/IKKε” 的研究論文。本研究揭示了小核糖核酸病毒結構蛋白 VP2 抑制宿主先天免疫的新型分子機制，闡明了其通過招募 E3 泛素連接酶 RNF114 促進 IKBKE 的 K33 連接泛素化，進而經 CALCOCO2 介導的選擇性自噬降解 IKBKE 的核心功能，且該機制在小核糖核酸病毒中具有保守性。

先天免疫是宿主抵御病毒感染的第一道防線，IKBKE 作為先天免疫通路的關鍵激酶，可磷酸化 IRF3/7 啟動 I 型干擾素產生，而小核糖核酸病毒已進化出多種策略逃避免疫監視。選擇性自噬是病毒操縱宿主免疫的重要途徑，已有研究表明小核糖核酸病毒的非結構蛋白可通過自噬降解免疫分子，但結構蛋白 VP2 在先天免疫調控中的作用尚未明確。

已知小核糖核酸病毒 VP2 參與病毒顆粒組裝和入侵，但能否及如何調控自噬與先天免疫的交叉通路仍屬未知；IKBKE 常成為病毒靶向的關鍵分子，但小核糖核酸病毒是否通過自噬降解 IKBKE、其具體調控的泛素化類型及自噬受體尚未闡明。此外，不同小核糖核酸病毒 VP2 的功能是否保守，也缺乏系統研究。本研究聚焦小核糖核酸病毒 VP2 與選擇性自噬、先天免疫的互作機制，解析其降解 IKBKE 的分子路徑及保守性，為理解病毒免疫逃逸策略提供理論基礎。

1. SVA VP2 抑制 I 型 IFN 產生和 ISGs 表達

為探究 SVA 結構蛋白對先天免疫的調控作用，將 SVA VP2 等結構蛋白轉染 HEK-293T 和 PK-15 細胞，用 SeV 或 poly (I:C) 激活 I 型 IFN 通路。結果顯示，VP2 顯著抑制 IFNB 和 ISRE 啟動子活性（圖 1A-B），且呈劑量依賴性阻斷 SeV/poly (I:C) 誘導的 IFNB 啟動子激活（圖 1C-D）；qPCR 檢測發現 VP2 顯著降低 IFNB 及 IFIT2、OAS1 等 ISGs 的 mRNA 水平（圖 1E-F）。敲低 VP2 后，SVA 對 poly (I:C) 誘導的 ISGs 表達抑制作用減弱（圖 1G）。這些表明，SVA VP2 可有效阻斷 I 型 IFN 信號通路，抑制宿主抗病毒先天免疫應答。

2. SVA VP2 特異性靶向降解 IKBKE

為明確 VP2 調控 IFN 通路的分子靶點，檢測 RLR 通路核心分子表達。WB 結果顯示，VP2 僅顯著下調 IKBKE 蛋白水平，對 MDA5、RIGI 等其他分子無影響（圖 2A）；轉染 VP2 可劑量依賴性降解 HA 標簽及內源性 IKBKE，不影響 HA-RIGI、HA-IRF3（圖 2B-D、S2A-C）。qPCR 證實 VP2 不影響 IKBKE mRNA 表達（圖 2E、S2F）；SVA 感染后，IKBKE 蛋白隨感染時間逐漸減少，mRNA 無變化（圖 2F-G、S2G-H）。這些表明，SVA VP2 在蛋白水平特異性靶向降解 IKBKE，且該效應在人源和豬源細胞中均存在。

3. SVA VP2 與 IKBKE 和 RIGI 相互作用

為驗證 VP2 與免疫分子的相互作用，通過 co-IP 實驗發現，VP2 可特異性結合 IKBKE 和 RIGI，不與 MDA5、MAVS 等其他分子相互作用（圖 2H-I、S2I-K）；SVA 感染時，VP2 與 IKBKE 在細胞質中共定位（圖 2K、S2L），且與 RIGI 也存在胞質共定位（圖 S2M）。進一步檢測顯示，VP2 可抑制 TBK1 與 IKBKE、IKBKE 與 IRF3 的相互作用（圖 2L-M），但不影響 RIGI 與 MAVS 的結合（圖 S2N）。這些表明，VP2 通過與 IKBKE、RIGI 直接相互作用，干擾 I 型 IFN 信號復合物的形成，阻礙信號傳導。

4. SVA VP2 通過 CALCOCO2 介導的選擇性自噬降解 IKBKE

為闡明 IKBKE 的降解途徑，用蛋白酶體抑制劑 MG132、溶酶體抑制劑 CQ/3-MA 處理細胞。結果顯示，CQ 和 3-MA 可逆轉 VP2 誘導的 IKBKE 降解，MG132 無作用（圖 3A）；VP2 可促進 LC3-I 向 LC3-II 轉化，增加 LC3 自噬體 形成（圖 3B-C、S3A-B）。篩選自噬受體發現，僅 CALCOCO2 可增強 VP2 對 IKBKE 的降解，且 VP2 與 CALCOCO2 在感染時相互作用并共定位（圖 3D-F）。CALCOCO2 敲除細胞中，VP2 無法降解 IKBKE，SVA 復制及對 ISGs 的抑制作用均減弱（圖 3G-K）。這些表明，VP2 通過 CALCOCO2 介導的選擇性自噬降解 IKBKE，促進病毒復制。

5. SVA VP2 增強 IKBKE 的 K33 連接泛素化（K490 位點）

為探究自噬降解的分子標記，檢測 IKBKE 的泛素化修飾。結果顯示，VP2 可劑量依賴性增強 IKBKE 的總泛素化，且特異性促進 K33 連接泛素化（圖 4A-B、S4A），不影響 K63 連接泛素化（圖 S4B）。通過賴氨酸突變篩選發現，僅 IKBKE K490R 突變可顯著阻斷 VP2 誘導的泛素化及降解，其他位點突變無影響（圖 4C-D）。這些表明，VP2 通過促進 IKBKE K490 位點的 K33 連接泛素化，為 CALCOCO2 識別提供分子信號，進而介導其自噬降解。

6. RNF114 是介導 IKBKE 泛素化的 E3 連接酶

為篩選介導 IKBKE 泛素化的 E3 連接酶，通過質譜鑒定并驗證發現，VP2 可與 RNF114 等互作，且 IKBKE 特異性結合 RNF114（圖 5A-B、S5A-B）。RNF114 可降解 IKBKE 并增強 VP2 的降解效應，敲低 RNF114 后，IKBKE 降解受阻（圖 5C-D）；RNF114 可促進 IKBKE 的 K33 連接泛素化（圖 S5C），VP2 可劑量依賴性增強 IKBKE 與 RNF114 的相互作用（圖 5F）。敲低 RNF114 后，SVA 復制及對 ISGs 的抑制作用減弱（圖 5G-J）。這些表明，RNF114 是 VP2 介導 IKBKE K33 泛素化的關鍵 E3 連接酶。

7. VP2 的特定區域和關鍵殘基介導與 IKBKE 的相互作用

為明確 VP2 與 IKBKE 相互作用的結構基礎，構建 VP2 缺失突變體發現，aa1-80 和 aa201-284 區域是降解 IKBKE 及抑制 IFN 通路的關鍵（圖 6A-E）；IKBKE 的 ΔPK 和 ΔDDX3X 突變體仍可被 VP2 降解并結合（圖 6F-H）。點突變驗證顯示，IKBKE 的 E148 殘基及 VP2 的 C34、D39、T41、R210 殘基是相互作用的核心，突變后結合及降解均受阻（圖 7A-E）。這些表明，VP2 通過特定功能區域和關鍵氨基酸殘基與 IKBKE 相互作用，介導其降解。

8. 小核糖核酸病毒 VP2 蛋白功能保守

為驗證 VP2 功能的保守性，轉染 FMDV、EV71 的 VP2。結果顯示，三者均能抑制 IFNB 和 ISRE 啟動子活性（圖 8A）；SVA-VP2、EV71-VP2 在 HEK-293T 中，FMDV-VP2 在 PK-15 中均可降解 IKBKE，且依賴 ATG7/ATG5 及 CALCOCO2（圖 8B-I）。序列比對顯示，VP2 的關鍵殘基 R210 在三者中高度保守（圖 S6）。這些表明，小核糖核酸病毒的 VP2 蛋白共享 “泛素化 - 選擇性自噬” 降解 IKBKE 的保守機制，抑制先天免疫。

9. 自噬對小核糖核酸病毒復制至關重要

為探究自噬在病毒復制中的作用，使用 ATG7、ATG5、CALCOCO2 敲除細胞系感染 SVA、EV71、FMDV。結果顯示，敲除后 IKBKE 降解受阻，病毒 3D 蛋白表達、mRNA 轉錄及病毒滴度均顯著降低（圖 9A-L、S7A-F）；過表達 VP2 可促進 SVA、FMDV、EV71 的復制（圖 S7G-L）。這些表明，小核糖核酸病毒依賴自噬途徑降解 IKBKE，解除宿主先天免疫抑制，進而促進自身復制，自噬是其復制的關鍵支撐。

本研究揭示了小核糖核酸病毒 VP2 蛋白通過選擇性自噬降解 IKBKE 以抑制先天免疫的保守機制：VP2 招募 E3 泛素連接酶 RNF114，促進 IKBKE 在 K490 位點發生 K33 連接泛素化修飾，隨后被選擇性自噬受體 CALCOCO2 識別并轉運至自噬體降解，進而阻斷 I 型干擾素通路，促進病毒復制；且 SVA、FMDV、EV71 等小核糖核酸病毒的 VP2 蛋白均具備該功能，證實其保守性。

本研究為開發靶向 VP2-RNF114-CALCOCO2-IKBKE 通路的抗病毒藥物提供了新思路，也為優化小核糖核酸病毒溶瘤療法提供了理論依據，有望為相關疾病治療開辟新方向。

來源：ZhaoSunLab

編輯：吃一口小貓