寡核苷酸類藥物生殖毒性研究的特殊考量

寡核苷酸療法（ONT）是通過(guò)短核酸序列調(diào)控基因表達(dá)的重要藥物形式，1990年代首個(gè)反義寡核苷酸（ASO）獲FDA批準(zhǔn)，2018年首個(gè)小干擾RNA（siRNA）獲批；截至2025年，全球獲批ONT數(shù)量大幅增加，眾多候選藥物進(jìn)入臨床試驗(yàn)，其在罕見(jiàn)病治療中優(yōu)勢(shì)顯著，且逐漸用于常見(jiàn)疾病治療。ONT應(yīng)用范圍和復(fù)雜性擴(kuò)大，但其非臨床安全性評(píng)估（尤其是發(fā)育與生殖毒性（DART）評(píng)估）缺乏統(tǒng)一指南，制藥界在設(shè)計(jì)ONT專屬DART方案時(shí)積累了一定經(jīng)驗(yàn)，亟需交流分享。

由健康與環(huán)境科學(xué)研究所（HESI）DART技術(shù)委員會(huì)于2023年10月17-18日在華盛頓特區(qū)舉辦，參會(huì)者包括制藥企業(yè)、CRO及全球監(jiān)管機(jī)構(gòu)代表。

常規(guī)DART研究通常覆蓋一代完整生殖周期（從一代受孕到下一代受孕），分為A-F六個(gè)階段，通過(guò)不同研究評(píng)估：1）生育力與早期胚胎發(fā)育（FEED）研究：評(píng)估A-B階段（交配前至著床前）；2）胚胎-胎兒發(fā)育（EFD）研究：評(píng)估C階段（著床至硬腭閉合）；3）圍產(chǎn)期發(fā)育（PPND）研究：評(píng)估D-F階段（胎兒成熟、出生至斷奶、斷奶至性成熟）。如下圖所示。

EFD研究通常需在兩種種屬（嚙齒類和非嚙齒類）中開(kāi)展，至少一種具有藥理反應(yīng)性；生物制劑僅在兩種種屬均有藥理反應(yīng)性時(shí)，才需在兩種種屬中進(jìn)行研究。關(guān)于DART研究與臨床開(kāi)發(fā)的時(shí)間銜接，依據(jù)ICH M3(R2)指南，EFD研究需在育齡期女性（WOCBP）入組前或根據(jù)地區(qū)要求在III期臨床試驗(yàn)前完成。FEED研究需在III期臨床試驗(yàn)前完成。PPND研究需在上市申請(qǐng)?zhí)峤磺巴瓿伞?/p>

ONT雖按小分子藥物監(jiān)管，但具備部分大分子藥物特征，目前缺乏國(guó)際統(tǒng)一的ONT非臨床安全性評(píng)估指南（僅日本藥品和醫(yī)療器械局（PMDA）于2020年發(fā)布相關(guān)指南）。現(xiàn)有ONT DART評(píng)估方法采用混合策略，同時(shí)應(yīng)用小分子藥物（如ICH M3）和生物制劑（如ICH S6）的評(píng)估原則；ICH S5(R3)指南雖涵蓋小分子和生物制劑的DART評(píng)估考量，但ONT獨(dú)特屬性使其在應(yīng)用該指南原則時(shí)仍存在諸多疑問(wèn)。2024年11月，ICH管理委員會(huì)批準(zhǔn)一份概念文件，計(jì)劃制定新ICH安全指南《寡核苷酸療法非臨床安全性評(píng)估》，DART評(píng)估建議將是其中需協(xié)調(diào)的內(nèi)容。2024年11月，F(xiàn)DA發(fā)布ONT非臨床安全性評(píng)估指南草案，其中包含DART評(píng)估要求，其基本原則與本次研討會(huì)成果一致。

本文就HESI會(huì)議中的相關(guān)觀點(diǎn)進(jìn)行總結(jié)。

ONT的獨(dú)特產(chǎn)品屬性

ONT具有獨(dú)特產(chǎn)品屬性，下圖對(duì)比了小分子、ONT和生物藥的區(qū)別。

應(yīng)用DART原則時(shí)需逐案考量，核心屬性包括以下5點(diǎn)：

化學(xué)合成與修飾：ONT為化學(xué)合成產(chǎn)物，含與內(nèi)源性核酸不同的化學(xué)修飾，可能引發(fā)與化學(xué)/物理結(jié)構(gòu)相關(guān)的毒性。

靶向性與種屬特異性：其靶向性和種屬特異性介于小分子藥物與生物制劑之間，雖設(shè)計(jì)為與特定核苷酸序列結(jié)合（可能具有種屬特異性），但也存在與非預(yù)期靶點(diǎn)結(jié)合的潛在可能。

細(xì)胞分布與藥效動(dòng)力學(xué)：能快速進(jìn)入靶細(xì)胞并在其中滯留，長(zhǎng)時(shí)間發(fā)揮藥效動(dòng)力學(xué)（PD）作用，形成獨(dú)特的動(dòng)力學(xué)和藥理學(xué)特性，設(shè)計(jì)DART研究給藥方案時(shí)需納入考量。

遞送偶聯(lián)成分：常含遞送偶聯(lián)成分（如N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體抗體），可促進(jìn)靶組織細(xì)胞對(duì)ONT的攝取，同時(shí)減少向其他組織的分布。

平臺(tái)復(fù)用性與證據(jù)權(quán)重法：相同的“平臺(tái)”（含偶聯(lián)成分、連接子、化學(xué)修飾）可用于多種ONT，引發(fā)“能否將一種ONT的研究數(shù)據(jù)復(fù)用至同平臺(tái)其他ONT”的疑問(wèn)；雖可采用證據(jù)權(quán)重（WoE）法評(píng)估ONT的DART風(fēng)險(xiǎn)，但可能需結(jié)合實(shí)驗(yàn)或計(jì)算數(shù)據(jù)，以全面考量其對(duì)人類的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

ONT的DART研究毒性類型

ONT的DART研究中，毒性潛在來(lái)源可分為靶向毒性、脫靶毒性、化學(xué)/物理屬性相關(guān)毒性三類，具體差異如下：

也可參考下圖，更形象一些。

評(píng)估ONT毒性時(shí)，需先明確毒性機(jī)制：1）對(duì)于依賴雜交的毒性（靶向/脫靶），可通過(guò)人類數(shù)據(jù)庫(kù)的計(jì)算機(jī)模擬分析、人類樣本體外實(shí)驗(yàn)、基因生物學(xué)特征研究等方式預(yù)測(cè)；2）對(duì)于不依賴雜交的脫靶毒性，需考量化合物結(jié)構(gòu)、化學(xué)/物理屬性（含制劑影響）及受體/蛋白相互作用。

發(fā)育毒性研究中的特殊考量

母鼠給藥ONT后，可能對(duì)胎盤(pán)、發(fā)育中胚胎/胎兒這兩個(gè)普通毒性研究未涉及的部位產(chǎn)生靶向或脫靶毒性，需關(guān)注以下3點(diǎn)：1）毒性產(chǎn)生途徑：毒性可能源于ONT在這些部位的分布，也可能是ONT改變母體生理狀態(tài)（與胎盤(pán)或胚胎/胎兒無(wú)直接關(guān)聯(lián)）間接導(dǎo)致；2）種屬差異影響：不同種屬的發(fā)育生物學(xué)特征差異會(huì)影響毒性評(píng)估結(jié)果的轉(zhuǎn)化，例如：人類胎盤(pán)是唯一的營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)器官，也是外源物質(zhì)進(jìn)入胚胎的潛在通道；而大鼠和兔的早期妊娠中，內(nèi)臟卵黃囊承擔(dān)該功能，后期才由胎盤(pán)接管。大鼠早期器官發(fā)生階段，內(nèi)臟卵黃囊完全包裹胚胎；兔的內(nèi)臟卵黃囊則保持開(kāi)放，胚胎可能直接接觸母體分泌物，增加外源物質(zhì)進(jìn)入胚胎的途徑。采用小型豬等替代動(dòng)物模型時(shí)，還需考量胎盤(pán)類型和特征的差異；3）胚胎暴露的種屬差異：早期發(fā)育階段的種屬差異還會(huì)影響胚胎藥物暴露的調(diào)控，如母體與胚胎/胎兒間的pH梯度、胎盤(pán)轉(zhuǎn)運(yùn)體和代謝酶、胚胎與母體體液中的蛋白結(jié)合差異等。

雖可通過(guò)研究妊娠動(dòng)物器官發(fā)生期的ONT暴露動(dòng)力學(xué)，為動(dòng)物研究結(jié)果提供背景，但動(dòng)物妊娠期任一階段胎兒體內(nèi)ONT的有無(wú)，均無(wú)法直接預(yù)測(cè)其能否進(jìn)入人類胚胎/胎兒。

受試種屬的藥理學(xué)相關(guān)性考量

常規(guī)種屬的局限性：ICH S5(R3)將大鼠、兔定義為DART研究的“常規(guī)受試種屬”，因其特性明確、能有效檢測(cè)治療相關(guān)效應(yīng)，但ONT具有序列依賴性和種屬特異性，常規(guī)種屬可能無(wú)法滿足靶向評(píng)估需求，人類和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物（NHP）常是唯一具有藥理學(xué)相關(guān)性的種屬。

替代ONT的應(yīng)用：若條件允許，可設(shè)計(jì)與常規(guī)DART種屬目標(biāo)基因類似物結(jié)合的替代ONT，以全面評(píng)估ONT的藥理學(xué)相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)。帕替瑞南（ONPATTRO?）、奈多司蘭（RIVFLOZATM）等獲批GalNAc-siRNA已采用該方法，替代分子的特性分析和研究設(shè)計(jì)將在下文進(jìn)一步說(shuō)明。

替代ONT的局限性：因傳統(tǒng)DART種屬的基因/蛋白表達(dá)差異或目標(biāo)基因缺失，替代ONT方法可能不適用；若替代ONT需結(jié)合種屬特異性遞送成分（如抗體），會(huì)進(jìn)一步增加復(fù)雜性，相關(guān)內(nèi)容將在下文詳述。

NHP的應(yīng)用限制：NHP因藥理學(xué)相關(guān)性，常被用于ONT的普通毒性評(píng)估，但NHP的DART評(píng)估在設(shè)計(jì)和范圍上靈活性低、穩(wěn)健性差（每只母猴僅1個(gè)后代，評(píng)估數(shù)量有限），僅在無(wú)法預(yù)先排除靶向/脫靶風(fēng)險(xiǎn)，且常規(guī)種屬、替代模型經(jīng)全面評(píng)估被證明不適用時(shí)，才可考慮使用NHP。

ONT的PK/PD脫節(jié)問(wèn)題

ONT的PK/PD特性特殊，需針對(duì)性調(diào)整DART研究方案，核心考量包括3點(diǎn)：

給藥頻率差異：ONT從體循環(huán)清除快，但組織滯留時(shí)間長(zhǎng)，藥效持續(xù)久，臨床常采用低頻給藥（每周、每月、每季度甚至每年1次），一般毒理研究也會(huì)模仿該模式采用間歇給藥；但DART評(píng)估（尤其是EFD研究）需在關(guān)鍵發(fā)育階段維持持續(xù)的全身暴露和藥理活性，妊娠期低頻間歇給藥并非最佳選擇，需增加給藥頻率，以維持兩次給藥間的血漿暴露量，后續(xù)會(huì)詳述。

給藥起始時(shí)間調(diào)整：需結(jié)合目標(biāo)蛋白調(diào)控的起始時(shí)間、給藥時(shí)間、目標(biāo)RNA降解時(shí)間，調(diào)整給藥起始點(diǎn)，確保DART研究中目標(biāo)暴露期內(nèi)，能實(shí)現(xiàn)預(yù)期的蛋白調(diào)控藥理效果。

給藥途徑選擇：ONT的臨床給藥途徑（如鞘內(nèi)注射）可能難以在非臨床DART種屬中復(fù)制，需選擇最適合的DART研究給藥途徑，以模擬相關(guān)臨床暴露。

證據(jù)權(quán)重法與平臺(tái)法的應(yīng)用

證據(jù)權(quán)重法（WoE）：若有充足信息說(shuō)明ONT靶向藥理學(xué)相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)，可依據(jù)ICH S5(R3)、ICH S6(R1)及相關(guān)文獻(xiàn)，在ONT的DART策略中應(yīng)用WoE法。

平臺(tái)法：平臺(tái)法是ONT特有的概念，理論上可用于支持EFD評(píng)估僅用單一種屬，或豁免全面的脫靶DART潛在風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，但研討會(huì)召開(kāi)時(shí)，該方法尚未應(yīng)用于獲批ONT。其核心邏輯為：若同平臺(tái)（相同偶聯(lián)成分、連接子、化學(xué)修飾）的另一種ONT已通過(guò)EFD研究證明無(wú)不良效應(yīng)，且與未測(cè)試候選藥物僅核苷酸序列不同，則針對(duì)不依賴雜交的脫靶毒性風(fēng)險(xiǎn)的“平臺(tái)法”，可補(bǔ)充依賴雜交的DART（靶向/脫靶）風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，為整體DART風(fēng)險(xiǎn)提供充足信息；若某平臺(tái)出現(xiàn)DART信號(hào)，該數(shù)據(jù)也可納入WoE，可能無(wú)需額外開(kāi)展DART研究。不過(guò)，這種偏離小分子藥物EFD策略的方法，目前大概率不適用于多數(shù)ONT；若需大幅偏離ICH要求，建議與監(jiān)管機(jī)構(gòu)溝通并獲得批準(zhǔn)。

下文詳細(xì)介紹下會(huì)議細(xì)節(jié)：

監(jiān)管機(jī)構(gòu)視角

日本藥品和醫(yī)療器械局（PMDA）

PMDA全面回顧了日本針對(duì)ONT評(píng)估的指南，重點(diǎn)聚焦DART評(píng)估中的潛在毒性。該指南將ONT誘導(dǎo)的毒性分為雜交依賴性和雜交非依賴性兩類。

在靶向毒性評(píng)估方面，PMDA強(qiáng)調(diào)使用具有藥理學(xué)相關(guān)性的動(dòng)物模型的重要性，且更傾向于使用替代ONT而非NHP。

針對(duì)雜交依賴性脫靶毒性，主張采用定制化評(píng)估方法，如計(jì)算機(jī)模擬分析和人類細(xì)胞的RNA測(cè)序（RNAseq）。同時(shí)強(qiáng)調(diào)需開(kāi)展全面的體外基因表達(dá)分析（尤其針對(duì)siRNA的安全性評(píng)估），且要確保計(jì)算機(jī)模擬算法和數(shù)據(jù)庫(kù)的可靠性。

在評(píng)估雜交依賴性靶向與脫靶毒性時(shí)，若ONT的胎盤(pán)轉(zhuǎn)運(yùn)顯示胎兒暴露量低于生物學(xué)顯著水平，該數(shù)據(jù)可作為WoE評(píng)估的一部分。

最后，PMDA探討了ONT化學(xué)修飾引發(fā)的雜交非依賴性脫靶毒性，指出EFD研究中給藥頻率設(shè)定的挑戰(zhàn)，以及采用平臺(tái)法減少臨床候選藥物毒性研究的可行性問(wèn)題。PMDA代表特別強(qiáng)調(diào)，鑒于有研究報(bào)道ASO在非臨床研究中存在序列依賴性急性毒性，而平臺(tái)法無(wú)法排除此類毒性，因此對(duì)采用平臺(tái)法評(píng)估毒性持謹(jǐn)慎態(tài)度。

荷蘭藥品評(píng)估委員會(huì)（MEB）

MEB指出，歐盟目前尚未就ONT形成統(tǒng)一立場(chǎng)。MEB希望進(jìn)一步探索如何利用同類產(chǎn)品的數(shù)據(jù)，免除新產(chǎn)品開(kāi)展傳統(tǒng)DART研究的需求（即證據(jù)權(quán)重法）。例如，若產(chǎn)品具有相同的化學(xué)結(jié)構(gòu)/骨架修飾且靶向同一基因，但序列不同，可考慮通過(guò)非DART體外或體內(nèi)橋接研究，判斷序列變化是否會(huì)引發(fā)新的毒性；若已有ONT非偶聯(lián)形式的DART數(shù)據(jù)，可利用該數(shù)據(jù)評(píng)估相同序列GalNAc偶聯(lián)形式的DART風(fēng)險(xiǎn)。

美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）

在DART安全性評(píng)估方面，F(xiàn)DA強(qiáng)調(diào)ONT屬于ICH S5(R3)的適用范圍，但同時(shí)也指出ONT的特定屬性（尤其是體循環(huán)清除快、組織滯留時(shí)間長(zhǎng)，進(jìn)而導(dǎo)致PD持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)）給DART研究（尤其EFD研究）設(shè)計(jì)帶來(lái)獨(dú)特挑戰(zhàn)。

關(guān)于EFD研究建議，F(xiàn)DA的立場(chǎng)與PMDA基本一致：通常要求在兩種物種中開(kāi)展EFD評(píng)估，且至少在一種物種中評(píng)估預(yù)期藥理活性。若NHP是唯一對(duì)臨床候選藥物有反應(yīng)的物種，F(xiàn)DA同樣更傾向于在嚙齒類研究中使用替代分子開(kāi)展試驗(yàn)，而非直接使用NHP。

FDA要求使用兩種物種開(kāi)展研究的依據(jù)是：堿基序列對(duì)雜交非依賴性脫靶毒性有顯著且不可預(yù)測(cè)的影響，且不同化學(xué)結(jié)構(gòu)也可能產(chǎn)生獨(dú)特的毒性效應(yīng)。

案例研究與討論

11位來(lái)自活躍開(kāi)發(fā)ONT的大小型生物技術(shù)或制藥企業(yè)的代表進(jìn)行了案例分享。這些案例圍繞生殖周期不同階段的劑量設(shè)定與給藥頻率、種屬選擇等展開(kāi)。

（一）劑量水平選擇

確定合理的高劑量是科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)腄ART評(píng)估的核心。根據(jù)ICH S5(R3)，DART的劑量合理性需基于所有可用信息，包括藥理學(xué)、PK和重復(fù)給藥毒性數(shù)據(jù)。

對(duì)于ONT，除需遵循ICH S5(R3)中關(guān)于靶向藥理相關(guān)PD的通用考量外，脫靶效應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)與器官內(nèi)蓄積往往直接影響劑量選擇。低劑量水平的設(shè)定遵循標(biāo)準(zhǔn)實(shí)踐：通過(guò)評(píng)估劑量反應(yīng)確定未觀察到不良效應(yīng)水平（NOAEL），并參考預(yù)期或計(jì)劃的臨床劑量。

由于ONT獨(dú)特的動(dòng)力學(xué)與PD特性，劑量設(shè)定需考慮靶組織濃度。這一步可能需要額外研究或檢測(cè)終點(diǎn)，例如在兔中開(kāi)展暴露評(píng)估——兔通常不用于一般毒性研究。高劑量與劑量范圍的選擇需結(jié)合ONT的特殊考量，同時(shí)遵循成熟的DART與一般毒理研究實(shí)踐。

1.常見(jiàn)劑量選擇依據(jù)及優(yōu)劣

毒性終點(diǎn)法或暴露邊際法是最常用的劑量選擇依據(jù)，下表列出了各種劑量選擇方法及簡(jiǎn)要優(yōu)劣對(duì)比。ONT的DART評(píng)估中，多采用基于最大耐受劑量（MTD）、血漿暴露或劑量邊際的劑量選擇方法。

（二）給藥方案

ONT的劑量水平與給藥方案選擇往往相互關(guān)聯(lián)。研討會(huì)強(qiáng)調(diào)，DART研究的劑量與給藥方案需綜合考量計(jì)劃臨床給藥方案、ONT的化學(xué)/物理特性、PD、PK和毒性特征，以確保關(guān)鍵DART時(shí)期的適當(dāng)全身暴露，為人類風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供充分依據(jù)，如下表所示。

1.不同DART研究階段的給藥方案共識(shí)

EFD研究：盡管臨床低頻給藥，但研討會(huì)共識(shí)認(rèn)為，EFD研究中需在整個(gè)器官發(fā)生期維持PD效應(yīng)與足夠全身暴露，以覆蓋化合物所有潛在敏感期。這一原則適用于所有藥物類型，但對(duì)ONT而言，需平衡“高頻給藥維持穩(wěn)定暴露”與“避免組織蓄積、過(guò)度PD效應(yīng)或組織負(fù)荷相關(guān)毒性（與臨床給藥模式無(wú)關(guān)）”。

FEED研究與PPND后期（非妊娠期）：共識(shí)認(rèn)為，采用與一般毒理研究一致的間歇給藥即可滿足安全性評(píng)估需求，前提是給藥間隔不超過(guò)臨床預(yù)期頻率。

2.平衡暴露與蓄積的給藥方案設(shè)計(jì)

有多種給藥方案可在“保障發(fā)育敏感期暴露”與“減少組織蓄積、過(guò)度PD效應(yīng)或超出耐受性”之間實(shí)現(xiàn)平衡（如上表）：

分次給藥：將一般毒理研究中的每周或每月劑量，拆分為每日或每周多次的小劑量。高劑量與方案設(shè)計(jì)通常以“避免親本毒性”為目標(biāo)，同時(shí)確保經(jīng)非臨床與臨床給藥方案調(diào)整后，基于血漿AUC的暴露邊際達(dá)到足夠水平（如25倍于MRHD）。但該方法的劣勢(shì)是，母鼠每日血漿Cmax可能低于臨床水平，進(jìn)而降低胚胎/胎兒的相關(guān)暴露。

組織濃度基準(zhǔn)法：通過(guò)對(duì)比“嚙齒類分次給藥后靶組織（如肝臟）濃度”與“普通毒性研究中同劑量但低頻給藥的組織濃度”，驗(yàn)證親本暴露是否充分，兩者應(yīng)達(dá)到等效水平。

3.分次給藥案例：ASO英利昔蘭（TEGSEDI?）

英利昔蘭的臨床獲批劑量為每周284mg（約4mg/kg/周）。在小鼠聯(lián)合FEED/EFD研究中，英利昔蘭的每周劑量為10.5、52.5、87.5mg/kg/周，小鼠活性替代ASO劑量為52.5mg/kg/周：

雄鼠在整個(gè)研究期間（約10周）均采用每周給藥。

雌鼠交配前每周給藥，器官發(fā)生期調(diào)整為隔天給藥（每周3.5次），劑量為3、15、25mg/kg/次。

兔EFD研究同樣采用每周3.5次給藥，劑量為2.5、5、15mg/kg/次（對(duì)應(yīng)每周8.75、17.5、52.5mg/kg）。

考慮到英利昔蘭在嚙齒類和非嚙齒類中的組織半衰期分別約為2周和4周，隔天給藥被認(rèn)為可平衡“評(píng)估所需的足夠暴露倍數(shù)”與“避免過(guò)度組織蓄積及潛在干擾毒性”。

4.其他給藥方案考量

特殊場(chǎng)景調(diào)整：需結(jié)合種屬PD相關(guān)性、是否需使用替代ONT、普通毒性研究提示的頻繁給藥耐受性、或臨床給藥途徑的技術(shù)挑戰(zhàn)設(shè)計(jì)方案。若無(wú)法耐受高頻給藥，可采用多組動(dòng)物錯(cuò)開(kāi)給藥時(shí)間的方式覆蓋不同妊娠日，但該方法因需大量孕鼠而較少使用。

給藥起始時(shí)間：需結(jié)合生殖周期階段確定。若需在DART研究常規(guī)給藥起始日前提前給藥，以在評(píng)估生殖/發(fā)育關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)前降低或調(diào)控目標(biāo)RNA/蛋白水平，需參考以下信息：給藥后目標(biāo)RNA（可能包括蛋白）的變化水平與持續(xù)時(shí)間；變化是否具有藥理相關(guān)性（如10%的降低可能無(wú)意義，需在發(fā)情周期評(píng)估、交配或器官發(fā)生前追加給藥）；蛋白半衰期（用于判斷僅評(píng)估RNA是否足夠，還是需同時(shí)評(píng)估蛋白——短半衰期蛋白的RNA與蛋白水平會(huì)同步變化，長(zhǎng)半衰期蛋白的RNA水平快速下降后，蛋白水平下降存在滯后，僅評(píng)估RNA無(wú)法準(zhǔn)確反映功能蛋白量）。這些因素將決定給藥提前時(shí)間與方案，以平衡預(yù)期效應(yīng)與避免過(guò)度蓄積。

聯(lián)合DART研究：可通過(guò)聯(lián)合研究實(shí)現(xiàn)合理給藥起始時(shí)間。例如，若需2周時(shí)間調(diào)控目標(biāo)蛋白，開(kāi)展雌鼠聯(lián)合FEED/EFD研究（A-D階段）比單獨(dú)研究更具策略性，可在交配與妊娠前達(dá)到充分藥理效應(yīng)。根據(jù)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)PD所需時(shí)間，也可在動(dòng)物著床前首次給藥，但需注意：若臨床或替代ONT導(dǎo)致著床前丟失，窩仔數(shù)減少或全窩丟失會(huì)影響FEED研究向EFD研究的延伸，需單獨(dú)開(kāi)展EFD研究。因此，在啟動(dòng)聯(lián)合FEED/EFD研究前，可通過(guò)“給藥起始于著床前的劑量探索性EFD研究”評(píng)估該風(fēng)險(xiǎn)。

5.替代ONT的給藥頻率與時(shí)機(jī)

替代ONT的給藥頻率與時(shí)機(jī)需根據(jù)預(yù)期藥理調(diào)整：若替代分子的PD活性持久，需基于母鼠靶組織中PD的持續(xù)時(shí)間確定給藥頻率，核心是“維持臨床相關(guān)PD效應(yīng)”并“避免與臨床無(wú)關(guān)的替代ONT脫靶效應(yīng)”。

盡管多數(shù)參會(huì)者認(rèn)可此方法，部分案例也采用了該給藥頻率，但需注意：以“在母鼠中引發(fā)PD效應(yīng)”為目標(biāo)設(shè)定的給藥頻率，無(wú)法完全覆蓋“胚胎或胎兒中直接發(fā)生PD效應(yīng)”的可能性，還需參考胚胎發(fā)生過(guò)程中目標(biāo)基因的發(fā)育表達(dá)信息。

（三）毒代動(dòng)力學(xué)考量

ONT的體循環(huán)半衰期較短，通常僅數(shù)小時(shí)，但在靶組織中的半衰期顯著更長(zhǎng)，導(dǎo)致其藥理效應(yīng)可維持?jǐn)?shù)周至數(shù)月。因此，ONT給藥可能出現(xiàn)特殊情況：特定時(shí)間點(diǎn)存在PD效應(yīng)，但無(wú)全身（如血漿）暴露。

1.ONT暴露評(píng)估的常規(guī)方法與調(diào)整

常規(guī)暴露評(píng)估：多數(shù)企業(yè)或申辦方通過(guò)在DART研究的首次和末次給藥日進(jìn)行毒代動(dòng)力學(xué)評(píng)估，或在達(dá)到假定暴露穩(wěn)態(tài)后評(píng)估全身暴露。

方法調(diào)整：可通過(guò)增加額外采樣時(shí)間點(diǎn)，確認(rèn)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)（如交配、著床、器官發(fā)生期）的全身暴露，該原則同樣適用于ONT。但需注意，確認(rèn)ONT本身的全身暴露可能并非最重要的考量點(diǎn)。

更全面的暴露評(píng)估：PD評(píng)估（mRNA和/或蛋白水平）與相關(guān)組織的生物分析，能更全面地反映ONT暴露情況。

2.ONT的胎兒暴露與討論

少量獲批ONT通過(guò)檢測(cè)胎盤(pán)、胎兒血漿、肝臟、腎臟等組織的濃度并評(píng)估PD，探究ASO和siRNA是否能到達(dá)胎兒部位。

從有限數(shù)據(jù)來(lái)看，胎盤(pán)內(nèi)可檢測(cè)到ASO和siRNA；胎兒肝臟中的ASO通常無(wú)法定量，而siRNA可能在胎兒組織和血漿中低水平存在。上市ONT奈多司蘭（RIVFLOZA?）在兔羊水樣本中被檢出，但這是唯一的羊水相關(guān)數(shù)據(jù)。

3.ONT的其他暴露途徑（精液、乳汁）

精液暴露：小分子藥物向精液的轉(zhuǎn)移率低，低分子量藥物通過(guò)精液轉(zhuǎn)移給女性伴侶，導(dǎo)致女性伴侶血藥濃度比男性低至少三個(gè)數(shù)量級(jí)。ONT分子量通常大于小分子、小于生物制劑，其經(jīng)陰道上皮吸收進(jìn)入全身循環(huán)的特征尚未明確，但預(yù)計(jì)吸收有限。即使ONT進(jìn)入循環(huán)，其體循環(huán)半衰期也較短（僅數(shù)小時(shí)）。總體而言，ONT通過(guò)精液轉(zhuǎn)移給男性患者的女性伴侶，并達(dá)到具有生物學(xué)意義的全身濃度的可能性，與小分子藥物相當(dāng)或更低。

乳汁暴露：ASO和部分siRNA在乳汁中可被定量，但通常水平較低。由于ONT口服生物利用度低，哺乳期暴露給母乳喂養(yǎng)嬰兒的全身暴露量可能可忽略不計(jì)。上市siRNA魯瑪司蘭（OXLUMO?）和伏妥司蘭（AMVUTTRA?）在幼崽體內(nèi)未被檢出；某GalNAc偶聯(lián)siRNA的PPND研究案例顯示，出生后第4天（PND4）幼崽體內(nèi)可檢測(cè)到暴露，PND11時(shí)暴露量下降，表明乳汁轉(zhuǎn)移水平低或無(wú)轉(zhuǎn)移。需注意，ONT制劑可能通過(guò)修飾提高口服生物利用度，若進(jìn)行此類修飾，需考量其對(duì)哺乳期暴露風(fēng)險(xiǎn)的潛在影響。

4.GalNAc偶聯(lián)ONT的PD評(píng)估

對(duì)于GalNAc偶聯(lián)ONT或其他遞送形式，需在母體靶組織（如肝臟、腎臟）評(píng)估ONT遞送相關(guān)的PD，也可考慮在相應(yīng)胎兒組織中評(píng)估PD；若目標(biāo)基因在其他母體組織中表達(dá)，這些組織也可能需要分析。由于胚胎-胎兒發(fā)育過(guò)程中基因表達(dá)水平和模式可能存在差異，需確定胎兒組織的評(píng)估時(shí)間點(diǎn)，同時(shí)考慮組織發(fā)育時(shí)間與足月前收集組織的技術(shù)難度。

（四）種屬選擇

1.常規(guī)DART種屬的選擇與ONT特殊性

常規(guī)種屬優(yōu)勢(shì)：根據(jù)ICH S5(R3)，大鼠或小鼠是DART評(píng)估最常用的嚙齒類種屬，兔是EFD評(píng)估最常用的非嚙齒類種屬，因其有豐富的歷史對(duì)照數(shù)據(jù)、妊娠周期短且穩(wěn)定、窩仔數(shù)多、動(dòng)物易獲取。

ONT的特殊性：ONT可能在大鼠或兔中無(wú)活性，但這些常規(guī)DART種屬仍可用于全面評(píng)估ONT的脫靶DART潛力。例如，近期獲批的GalNAc偶聯(lián)siRNA奈多司蘭（RIVFLOZA）的DART數(shù)據(jù)顯示，兔EFD研究中觀察到骨骼和心血管系統(tǒng)畸形，而嚙齒類模型中未檢出；給藥首日母兔體重下降，但隨后恢復(fù)至與對(duì)照組相當(dāng)?shù)捏w重。該畸形的發(fā)生機(jī)制尚不明確，但兔并非藥理學(xué)相關(guān)種屬，由此證明ONT的脫靶毒性在嚙齒類和兔中可能存在差異。

2.靶向（依賴雜交）DART評(píng)估的種屬選擇

藥理學(xué)相關(guān)種屬需求：靶向DART評(píng)估需使用藥理學(xué)相關(guān)種屬。ONT通常能在NHP中誘導(dǎo)預(yù)期藥理反應(yīng)，但NHP的DART評(píng)估因倫理、科學(xué)等原因存在挑戰(zhàn)，并非理想選擇。

替代ONT的應(yīng)用：可制備與人類目標(biāo)序列類似、化學(xué)結(jié)構(gòu)與臨床ONT完全一致的替代ONT，用于常規(guī)DART種屬（通常為大鼠或小鼠）。通過(guò)在DART研究中設(shè)置單獨(dú)組別，同時(shí)評(píng)估臨床候選藥物與替代分子，可將替代方法與臨床候選藥物的脫靶毒性（不依賴雜交的化學(xué)誘導(dǎo)毒性、依賴雜交的脫靶序列雜交毒性）評(píng)估相結(jié)合。如下圖所示。

替代ONT的研究設(shè)計(jì)：在同一EFD研究中同時(shí)使用嚙齒類替代ONT與臨床候選藥物，可在單一種屬中完成全面評(píng)估，第二種屬僅用于評(píng)估脫靶潛力。該嚙齒類替代方法也可應(yīng)用于FEED、PPND研究。雖加入替代分子組會(huì)增加動(dòng)物用量（相比標(biāo)準(zhǔn)小分子DART評(píng)估），但可避免使用NHP；且如ICH S5(R3)所述，評(píng)估臨床候選藥物脫靶效應(yīng)時(shí)，有時(shí)少于三個(gè)劑量水平即可滿足風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估需求。

3.替代ONT的特性考量

替代ONT的選擇標(biāo)準(zhǔn)：需在受試種屬中具有藥理活性、目標(biāo)基因敲降幅度等于或大于臨床候選ONT在人類中的預(yù)期幅度、序列長(zhǎng)度與化學(xué)修飾與臨床候選藥物相似。

替代ONT的定位：替代ONT不能替代臨床候選藥物的評(píng)估，兩者均需在DART研究中評(píng)估。

替代ONT的生產(chǎn)與特性：多數(shù)使用替代方法的案例表明，“研究級(jí)（research grade）”材料（non-GMP條件）已足夠，因其主要用途是證明目標(biāo)PD效應(yīng)并評(píng)估與PD相關(guān)的潛在DART風(fēng)險(xiǎn)。替代材料不用于臨床，也不適用于設(shè)定人類風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的安全邊際。

共識(shí)觀點(diǎn)：研討會(huì)共識(shí)認(rèn)為，替代方法是評(píng)估目標(biāo)敲降相關(guān)毒性的首選工具，優(yōu)于NHP。替代方法與NHP DART方法均可用于風(fēng)險(xiǎn)識(shí)別，但替代模型的優(yōu)勢(shì)在于可在常規(guī)種屬（通常為嚙齒類）中開(kāi)展更穩(wěn)健的DART評(píng)估。該建議與ICH S6(R1)中生物制劑“優(yōu)先在NHP中使用臨床候選藥物而非嚙齒類活性替代分子”的表述不同，但日本PMDA指南與美國(guó)FDA指南草案均認(rèn)可該方法在適用場(chǎng)景中的可行性。

4.轉(zhuǎn)基因或疾病狀態(tài)動(dòng)物模型的特性考量

評(píng)估靶向毒性的替代模型還包括轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，或在正常健康動(dòng)物模型中誘導(dǎo)疾病狀態(tài)藥理反應(yīng)。開(kāi)展DART研究前，需對(duì)這些替代模型進(jìn)行特性鑒定，確保品系的生殖和發(fā)育特性適合且穩(wěn)定，可用于DART測(cè)試。建議與監(jiān)管機(jī)構(gòu)溝通，確保模型使用的科學(xué)依據(jù)符合要求。

5.生物偶聯(lián)ONT的種屬選擇考量

生物偶聯(lián)ONT的發(fā)展：為提高ONT的代謝穩(wěn)定性、藥代動(dòng)力學(xué)性能和效力，研究人員已實(shí)現(xiàn)ONT向肝臟外靶組織的高效遞送，例如通過(guò)將ONT與單克隆抗體、抗原結(jié)合片段、細(xì)胞穿透肽、脂質(zhì)等配體偶聯(lián)，實(shí)現(xiàn)向骨骼肌、心臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等肝外組織的遞送。因此，處于研發(fā)階段的偶聯(lián)ONT類型不斷增加，以將RNA靶向療法應(yīng)用于更廣泛的組織和疾病。

額外考量要點(diǎn)：與非偶聯(lián)ONT（如連接子-ONT、游離ASO）或化學(xué)合成偶聯(lián)物（如GalNAc）相比，蛋白偶聯(lián)ONT療法的DART評(píng)估需更多考量：需基于偶聯(lián)ONT所有組分的藥理和非特異性特性，全面理解其安全性；若生物部分（如單克隆抗體、抗原結(jié)合片段）與ONT偶聯(lián)，除ONT本身外，還需考量生物遞送組分的過(guò)度藥理效應(yīng)；偶聯(lián)ONT與臨床前種屬的交叉反應(yīng)性，是制定安全性評(píng)估策略的重要因素。

種屬選擇策略：生殖風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估可使用與臨床候選ONT化學(xué)修飾和藥理特性相當(dāng)?shù)膰X類活性替代ONT；對(duì)于僅結(jié)合人類受體的偶聯(lián)ONT，可考慮使用敲入人類轉(zhuǎn)運(yùn)受體的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，在替代小鼠模型中評(píng)估臨床候選藥物；若NHP是唯一的藥理學(xué)相關(guān)種屬，可考慮使用替代種屬（如嚙齒類），在該種屬中使用經(jīng)適當(dāng)驗(yàn)證的嚙齒類活性替代ONT，并偶聯(lián)具有適當(dāng)交叉反應(yīng)性的遞送組分。

復(fù)雜偶聯(lián)ONT的評(píng)估方法：若復(fù)雜ONT偶聯(lián)物可選擇非NHP DART評(píng)估方法，在常規(guī)DART種屬（如嚙齒類）中分別測(cè)試各藥理組分（遞送蛋白偶聯(lián)物、ONT）的生殖毒性，可能是最謹(jǐn)慎可行的方法，但需注意各組分的潛在疊加效應(yīng)，以及與臨床候選藥物在組織分布上的差異；也可測(cè)試嚙齒類替代蛋白-ONT偶聯(lián)物或“雙重替代物”（含嚙齒類活性的蛋白和ONT）；若某類效應(yīng)已明確，或有足夠數(shù)據(jù)說(shuō)明遞送偶聯(lián)物受體結(jié)合與目標(biāo)敲降的生殖風(fēng)險(xiǎn)，可考慮采用WoE綜合評(píng)估，替代蛋白偶聯(lián)ONT的動(dòng)物研究。與所有藥物類型和ONT一樣，使用替代方法需提供科學(xué)依據(jù)，需考量潛在風(fēng)險(xiǎn)并與衛(wèi)生監(jiān)管機(jī)構(gòu)溝通達(dá)成共識(shí)。

6.非常規(guī)DART種屬（NHP、小型豬）

非常規(guī)種屬的適用場(chǎng)景：部分項(xiàng)目可能無(wú)法使用常規(guī)DART種屬（嚙齒類、兔）；若傳統(tǒng)DART種屬與人類在目標(biāo)RNA表達(dá)上存在差異或目標(biāo)RNA缺失，替代ONT也可能不適用。

研討會(huì)中無(wú)使用非常規(guī)種屬開(kāi)展DART研究的案例，但有兩個(gè)報(bào)告介紹了使用非常規(guī)種屬開(kāi)展幼年動(dòng)物研究，以支持兒科適應(yīng)癥。

（五）ONT脫靶DART評(píng)估的額外可用數(shù)據(jù)

ONT研發(fā)過(guò)程中產(chǎn)生的計(jì)算機(jī)模擬、體外、體內(nèi)數(shù)據(jù)，均可能用于DART評(píng)估，這些信息對(duì)判斷是否可采用WoE或平臺(tái)法評(píng)估特定ONT的DART風(fēng)險(xiǎn)至關(guān)重要，以下簡(jiǎn)要總結(jié)相關(guān)技術(shù)，包括識(shí)別依賴雜交和不依賴雜交的潛在毒性機(jī)制的方法。

1.依賴雜交的脫靶效應(yīng)評(píng)估

計(jì)算機(jī)模擬評(píng)估：在ONT設(shè)計(jì)與優(yōu)化階段，通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬評(píng)估依賴雜交的潛在作用，選擇ONT序列時(shí)盡量減少對(duì)人類基因組的非預(yù)期作用。若識(shí)別出可能與ONT雜交的基因，需進(jìn)一步研究ONT改變這些基因表達(dá)的可能性，包括雜交錯(cuò)配數(shù)量、在脫靶基因中的雜交位置、基因表達(dá)組織，同時(shí)需關(guān)注脫靶基因功能（尤其EFD研究，因基因在發(fā)育中胚胎和胎盤(pán)中的功能，可能與在成年器官中不同）。

實(shí)驗(yàn)性表達(dá)譜分析：選定候選ONT后，可通過(guò)實(shí)驗(yàn)性表達(dá)譜分析，研究依賴脫靶雜交的潛在下調(diào)效應(yīng)。通常將ONT轉(zhuǎn)染至細(xì)胞系或原代細(xì)胞的2D培養(yǎng)體系，通過(guò)定量PCR分析潛在脫靶基因的表達(dá)變化。若在相關(guān)濃度下觀察到顯著的基因表達(dá)變化（如達(dá)到相當(dāng)靶向效力的10倍），需進(jìn)一步研究這些基因，必要時(shí)采用體內(nèi)技術(shù)；若計(jì)算機(jī)模擬評(píng)估顯示非預(yù)期靶點(diǎn)可能僅在生殖組織、胎盤(pán)或胚胎/胎兒組織中表達(dá)，需使用能捕捉該表達(dá)的適當(dāng)細(xì)胞類型。

2.不依賴雜交的脫靶效應(yīng)評(píng)估

體外評(píng)估不依賴雜交的脫靶效應(yīng)，可通過(guò)RNA測(cè)序或類似方法，無(wú)偏倚地分析細(xì)胞中的基因表達(dá)變化。這類方法無(wú)需了解特定基因序列，可檢測(cè)不依賴作用機(jī)制的基因表達(dá)變化；可將人類細(xì)胞系或原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染或用目標(biāo)ONT處理，識(shí)別基因表達(dá)變化。但需注意，這類方法較新，需大量工作優(yōu)化細(xì)胞系統(tǒng)、確定后續(xù)步驟、理解體外結(jié)果向潛在體內(nèi)效應(yīng)的轉(zhuǎn)化。

3.替代模型在DART評(píng)估中的應(yīng)用

如ICH S5(R3)所述，體外和離體方法已被用作動(dòng)物研究的替代方法，預(yù)測(cè)對(duì)胚胎-胎兒發(fā)育的潛在影響，例如斑馬魚(yú)、大鼠或兔全胚胎培養(yǎng)、體外模型（如胚胎干細(xì)胞）。這些方法也可能檢測(cè)依賴和不依賴雜交的脫靶效應(yīng)，監(jiān)管機(jī)構(gòu)可能接受其作為DART評(píng)估的一部分，但需對(duì)其進(jìn)行嚴(yán)格驗(yàn)證以作為DART篩選工具（這一過(guò)程可能較為復(fù)雜）。此外，這些模型多為評(píng)估小分子藥物或化學(xué)品開(kāi)發(fā)，其在ONT評(píng)估中的適用性尚不清楚。

總結(jié)

1.設(shè)計(jì)DART策略與研究時(shí)，當(dāng)前采用哪些方法應(yīng)對(duì)ONTs的獨(dú)特屬性？

與小分子藥物評(píng)估的監(jiān)管要求一致，多數(shù)案例研究在標(biāo)準(zhǔn)DART試驗(yàn)中使用常規(guī)動(dòng)物種屬，即EFD研究用嚙齒類和兔， FEED及PPND研究用嚙齒類，旨在捕捉潛在的靶向與脫靶DART效應(yīng)。

對(duì)于處于研發(fā)或已獲批的ONTs（含ASO、siRNA），其劑量設(shè)定與給藥頻率策略結(jié)合了小分子與大分子方法，具體取決于產(chǎn)品屬性。

盡管給藥方案不同，但多數(shù)策略會(huì)通過(guò)特定給藥頻率維持全身暴露，以在胚胎快速發(fā)育期評(píng)估脫靶毒性或維持PD反應(yīng)。整體方法因所用模型類型、特定ONT或偶聯(lián)成分屬性、是否采用WoE法而存在差異。

不同案例研究與申辦方在劑量設(shè)定、生殖周期非妊娠階段給藥頻率、替代分子或替代模型研究設(shè)計(jì)、種屬/模型選擇及暴露或PD檢測(cè)方面的方法，均因產(chǎn)品屬性不同而有所區(qū)別。

2.非傳統(tǒng)小分子DART策略的替代方法，在實(shí)施與認(rèn)可方面是否有進(jìn)展？

研討會(huì)核心討論點(diǎn)之一：對(duì)于一系列化學(xué)結(jié)構(gòu)相同的ONTs，能否采用“平臺(tái)法”預(yù)測(cè)其DART終點(diǎn)效應(yīng)，而非對(duì)每個(gè)ONT開(kāi)展完整DART研究。具體而言，若某一ONT已完成全面DART研究，且另一化學(xué)結(jié)構(gòu)相同的ONT無(wú)特定藥理活性相關(guān)擔(dān)憂，前者研究中確認(rèn)的危害或無(wú)危害結(jié)論能否推廣至后者。

“平臺(tái)法”在研討會(huì)及現(xiàn)有公開(kāi)信息中均無(wú)該方法的應(yīng)用案例。不同地區(qū)監(jiān)管機(jī)構(gòu)對(duì)“平臺(tái)法”的態(tài)度未完全統(tǒng)一，擔(dān)憂即使ONT序列存在微小差異，也可能導(dǎo)致靶向效應(yīng)及脫靶毒性（雜交依賴性與非依賴性）的差異。

各地區(qū)監(jiān)管機(jī)構(gòu)一致認(rèn)為應(yīng)用該方法需滿足重要前提：首先明確“平臺(tái)”的定義，涵蓋偶聯(lián)結(jié)構(gòu)、化學(xué)連接子及化學(xué)修飾，僅當(dāng)ONT在這些方面完全一致時(shí)才可考慮“平臺(tái)法”；其次，需為平臺(tái)內(nèi)新ONT收集額外信息，包括通過(guò)可靠的計(jì)算機(jī)模擬（in silico）、體外甚至體內(nèi)試驗(yàn)，全面評(píng)估脫靶雜交依賴性或序列相關(guān)毒性風(fēng)險(xiǎn)。

新一代ONTs研發(fā)速度快，若相關(guān)ONT的化學(xué)/物理性質(zhì)存在差異，可能難以找到足夠相似的已完成DART評(píng)估的平臺(tái)進(jìn)行數(shù)據(jù)外推。

已明確多個(gè)需進(jìn)一步開(kāi)發(fā)的領(lǐng)域，或可改變嚴(yán)格采用小分子雙種屬EFD方法的需求，例如若體外或離體新方法經(jīng)驗(yàn)證可用于ONTs，則可納入應(yīng)用。對(duì)于種屬特異性強(qiáng)的ONT偶聯(lián)物，需開(kāi)發(fā)針對(duì)其兩部分成分毒性的評(píng)估策略。在制定DART評(píng)估新策略（含“平臺(tái)法”）時(shí)，需盡早與監(jiān)管機(jī)構(gòu)頻繁溝通，確保方案可被接受。

3.是否可明確種屬/模型選擇、動(dòng)物模型替代方案（用于捕捉寡核苷酸靶向與脫靶毒性潛力）、給藥方案、替代分子或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型研究設(shè)計(jì)等方面的最佳實(shí)踐？

參會(huì)者就以下適配多數(shù)ONTs屬性的研究設(shè)計(jì)方法達(dá)成共識(shí)：

妊娠期給藥頻率：臨床候選藥物脫靶評(píng)估需采用每日或隔日給藥等方案，維持妊娠期全身暴露穩(wěn)定；臨床候選藥物或替代分子的靶向評(píng)估，需采用能在妊娠期維持與臨床預(yù)期相似程度的穩(wěn)定靶基因敲低的給藥方案。

生殖周期非妊娠階段給藥頻率：生殖周期非妊娠階段（交配前、交配期、哺乳期）無(wú)需持續(xù)維持全身暴露，否則可能引發(fā)與組織蓄積相關(guān)的毒性，且不符合臨床給藥場(chǎng)景（每月至每年一次給藥即可實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)效靶標(biāo)調(diào)節(jié)）；FEED或PPND研究非妊娠階段采用每周給藥，更接近臨床給藥頻率，且能充分覆蓋生殖周期關(guān)鍵階段。

劑量設(shè)定：ICH S5(R3)中描述的標(biāo)準(zhǔn)高劑量選擇原則可適用，但需考慮臨床與非臨床研究在給藥頻率及靶基因敲低程度上的差異；EFD研究中應(yīng)對(duì)高劑量與不同給藥頻率的常用方法是“分次給藥”，例如將一般毒性研究中的周劑量按1/7或1/3拆分，分別每日或隔日給藥，以在維持相同周劑量的同時(shí)，保證妊娠期暴露穩(wěn)定。

種屬選擇：常規(guī)DART種屬（嚙齒類、兔）適用于ONTs DART研究，且至少需有一種種屬能體現(xiàn)藥理活性；即使無(wú)PD效應(yīng)，使用這些種屬仍具有合理性，可全面評(píng)估脫靶雜交依賴性與非依賴性效應(yīng)；優(yōu)先使用替代分子檢測(cè)PD效應(yīng)，而非采用NHPs進(jìn)行DART研究。

替代分子研究設(shè)計(jì)：替代ONT可用于評(píng)估靶基因敲低相關(guān)的DART潛在危害，但不能替代臨床候選藥物的脫靶評(píng)估，也無(wú)法提供風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估所需的劑量或暴露邊際信息；替代分子的所有研究設(shè)計(jì)需以靶標(biāo)調(diào)節(jié)為核心，其劑量選擇、給藥頻率與時(shí)間需盡量降低替代分子脫靶效應(yīng)的可能性（此類效應(yīng)與臨床給藥無(wú)關(guān)）。

體內(nèi)替代模型研究設(shè)計(jì)：疾病狀態(tài)模型等常規(guī)DART模型的替代模型，需充分表征其背景DART異常情況，并確保給予臨床候選藥物后能產(chǎn)生預(yù)期藥理作用。

暴露與PD評(píng)估：關(guān)于胎盤(pán)、胎兒腔室及乳汁中ONT暴露潛力的數(shù)據(jù)有限，生成ONT或ONT類別相關(guān)的胎盤(pán)/胎兒暴露或基因調(diào)節(jié)數(shù)據(jù)，可能為研究設(shè)計(jì)提供支持或作為WoE法的組成部分，但需考慮種屬間胎盤(pán)轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)力學(xué)差異及該數(shù)據(jù)對(duì)人類風(fēng)險(xiǎn)識(shí)別的整體價(jià)值；即使ONT不蓄積于胎盤(pán)或不進(jìn)入胎兒腔室，仍可能對(duì)胚胎-胎兒發(fā)育產(chǎn)生影響，因此胎兒無(wú)暴露不能排除開(kāi)展EFD或PPND研究的必要性。

4.隨著ONTs成分復(fù)雜性提升（含使用多種不同遞送偶聯(lián)物），該藥物類別發(fā)展過(guò)程中出現(xiàn)了哪些額外考量點(diǎn)？

隨著偶聯(lián)成分范圍擴(kuò)大、化學(xué)修飾增多（以靶向新組織腔室并擴(kuò)大適應(yīng)癥范圍），ONTs DART測(cè)試策略的復(fù)雜性不可避免。

如抗體偶聯(lián)siRNA案例所示，DART模型的種屬相關(guān)性及對(duì)特定藥代動(dòng)力學(xué)屬性的理解，將影響多數(shù)策略決策；但隨著ONT產(chǎn)品屬性演變，仍需依據(jù)ICHS6(R1)及相關(guān)資料（Cavagnaro.,2014）中描述的“個(gè)案處理”原則。

5.全球監(jiān)管機(jī)構(gòu)對(duì)ONTs的DART評(píng)估是否達(dá)成共識(shí)？

來(lái)自7個(gè)全球衛(wèi)生機(jī)構(gòu)的監(jiān)管人員參與研討會(huì)或發(fā)表演講，表明行業(yè)與監(jiān)管機(jī)構(gòu)在“為ONTs制定恰當(dāng)且具有科學(xué)依據(jù)的DART策略”這一共同目標(biāo)上的合作日益加強(qiáng)。

監(jiān)管機(jī)構(gòu)代表一致認(rèn)為ONTs需開(kāi)展DART評(píng)估，且評(píng)估總體應(yīng)遵循ICH S5(R3)中規(guī)定的小分子藥物原則；但因?qū)嵺`方法可能隨產(chǎn)品屬性不同而變化，需就具體評(píng)估方案與監(jiān)管機(jī)構(gòu)進(jìn)行個(gè)案溝通。

各方對(duì)“平臺(tái)法”的看法存在一定分歧，但均認(rèn)同需建立特征明確的平臺(tái)，并為平臺(tái)內(nèi)ONTs生成充足數(shù)據(jù)以支持該方法應(yīng)用。據(jù)悉，正在起草的ICH指南將就此達(dá)成共識(shí)。

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