FSHW | 高效且熱穩定的腸道多形擬桿菌肝素酶I的定向進化

本文系Food Science and Human Wellness原創編譯，歡迎分享，轉載請授權。

PART.01

Introduction

肝素是糖胺聚糖家族的一員，是一種由艾杜糖醛酸和葡萄糖醛酸二糖重復單元組成的酸性粘多糖。肝素可以特異性地與抗凝血酶結合而發揮抗凝功能。目前商業肝素主要從牛肺和豬小腸粘膜中提取。提取的肝素結構復雜，具有多種重要的生物學功能，臨床上普遍用于治療血栓、心血管疾病等疾病。它還可以作為宿主腸道的穩定碳源，可以有效調節腸道菌群結構，并具有潛在的益生元功能。低分子量肝素（LMWH）是肝素裂解產生的小片段肝素級分，其與蛋白質或細胞的結合能力降低，但抗凝活性顯著增加。LMWH與肝素相比具有多種優勢，例如利用率更高、半衰期更長、副作用更少。此外，LMWH的低分子量使其能夠更好地被腸道微生物降解，這有助于維持腸道穩態。因此，LMWH的制備方法非常重要。目前主要依賴于物理、化學、生物和合成方法來制備LMWH。近年來，生物酶催化因其條件溫和、高選擇性和低污染等優點而成為傳統裂解肝素策略的潛在有吸引力方法。

肝素酶I（HepI）是一類多糖裂解酶，能夠裂解肝素制備LMWH。HepI存在于多種來源，主要存在于肝素黃桿菌和擬桿菌中。最近的研究表明，人類腸道微生物可以有效降解肝素，其中擬桿菌是主要貢獻者。其他研究報道了從埃格氏擬桿菌和纖維素擬桿菌中分離出高活性HepI。這些研究僅關注HepI的活性，忽略了其熱穩定性。來自B. thetaiotaomicron（Bt-HepI）的HepI晶體結構已被廣泛研究，其具體降解機制已得到解決。Bt-HepI獨特的催化特性使其成為LMWH制備生物催化劑的有吸引力的候選者。不幸的是，野生型酶的熱穩定性較低，這表明生物轉化必須在遠低于環境溫度的情況下進行。這會影響肝素的解構速率并縮短酶的儲存時間。為了解決這些限制，使用各種合理的蛋白質工程方法可以顯著地提高HepI的熱穩定性。

迄今為止，關于HepI的熱穩定性的報道還很少。相比之下，使用合理蛋白質工程對酶進行實驗優化通常為酶工程提供更全面的方法，并且分子動力學模擬（MD）已經證明了酶的靈活區域。均方根偏差（RMSD）是反映蛋白質殘基靈活性的重要參數。殘差的均方根波動（RMSF）值越高，自由度越高。柔性區域由具有高RMSF值的殘基組成。二硫鍵在蛋白質折疊和穩定性、穩定蛋白質結構和調節蛋白質活性方面發揮著至關重要的作用。用于在蛋白質中形成二硫鍵以提高蛋白質穩定性的基于結構的設計方法在生物制藥和工業應用中取得了相當大的成功。因此，基于合理的蛋白質工程策略來提高HepI的熱穩定和活性具有很重要的意義。

江南大學食品學院田豐偉教授在本文以已報道的Bt-HepI晶體結構為研究對象，開發了一種合理的蛋白質工程策略，獲得了具有顯著增強熱穩定性和改善的肝素降解能力的Bt-HepI。這些發現應該有助于擴大Bt-HepI在人類制藥和食品工業中的應用。

圖1 Bt-HepI的整體改造示意圖

PART.02

Results

Bt-HepI定向進化的工作流程

本文采用了兩種策略來提高Bt-HepI的熱穩定性。第一種方法涉及通過MD對Bt-HepI中的柔性區域進行虛擬突變，以篩選潛在的突變位點。此外，對Bt-HepI進行二硫鍵虛擬突變，增加二硫鍵，從而提高熱穩定性。圖2顯示了設計的HepI定向進化的工作流程。工作流程從最初的酶和底物分子對接，到MD和二硫鍵虛擬突變篩選以確定影響HepI熱穩定性的關鍵氨基酸殘基，再到各種突變體的構建和實驗驗證。結構模擬之后進行實驗驗證并回歸到結構分析。

圖2 定向進化工作流程

Bt-HepI突變體酶性質、熱穩定性和酶動力學分析

本文通過比較不同溫度和pH水平下的相對活性來確定每個突變體的最佳反應溫度pH。Bt-HepIWT、Bt-HepIK247W、Bt-HepID204C/K208C和Bt-HepID204C/K208C/H189W的最佳反應pH相同（pH 8）。當His突變為Trp時，酸度增加，Bt-HepIH189W的最適pH從pH 8變為pH 7。由于Arg是堿性氨基酸，當Q198突變為R198時，突變體（Bt-HepIQ198R、Bt-HepIH189W/Q198R、Bt-HepID204C/K208C/Q198R、Bt-HepID204C/K208C/H189W/Q198R）的最適pH從pH 8變為pH 9。Bt-HepIWT、Bt-HepID204C/K208C和Bt-HepIK247W的最適反應溫度為40 ℃，而其余突變體的最適反應溫度為40～45 ℃。總體而言，氨基酸殘基的突變改變了酶的柔韌性并增加了其剛性，從而導致最佳反應溫度更高。為了確認突變體的熱穩定性，測量了它們在40 和50 °C時的半衰期。Bt-HepI的最佳溫度為40 °C。因此，50 °C對Bt-HepI來說是一個相對較高的溫度。Bt-HepIWT在50 °C下短時間內失去了一半的酶活性。每個突變體的半衰期都明顯高于Bt-HepIWT，表明這些突變提高了Bt-HepI的熱穩定性（圖5A-B）。與野生型酶相比，8個Bt-HepI突變體（Bt-HepIQ198R、Bt-HepIK247W、Bt-HepIH189W、Bt-HepID204C/K208C、Bt-HepIH189W/Q198R、Bt-HepID204C/K208C/H189W、Bt-HepID204C/K208C/Q198R和Bt-HepID204C/K208C/K208C/H189W/Q198R）在40 ℃下的半衰期分別增加了30.55%、14.63%、31.39%、51.61%、56.61%、74.07%、80.77%和104.35%，在50°C時分別為61.03%、30.82%、72.21%、101.32%、103.32%、113.75%、122.81%和143.5%。

圖3 Bt-HepI野生型和突變型酶的結構、催化效率和半衰期分析

PART.03

Conclusion

利用合理的蛋白質工程策略開發了具有高熱穩定性和高肝素降解活性的Bt-HepI突變體。與Bt-HepIWT相比，Bt-HepID204C/K208C/H189W/Q198R顯示出顯著更高的熱穩定性以及隨后更高的肝素降解活性。與Bt-HepIWT相比，Bt-HepID204C/K208C/H189W/Q198R在40℃和50℃下的半衰期分別延長了2.04倍和2.44倍。此外，Bt-HepID204C/K208C/H189W/Q198R的kcat/Km值比Bt-HepIWT高1.3倍。制備的LMWH平均分子量比野生型低1.8倍，符合國際藥典標準。Bt-HepI的低熱穩定性限制了其在肝素降解方面的應用。因此，我們的結果可能有助于使用HepI進行LMWH的工業生產。此外，蛋白質結構信息可以有效地應用于合理的蛋白質工程中，以增強目標蛋白質的熱穩定性，顯示出進一步應用的潛力。

01

第一作者

張川，男，現為江南大學食品學院在讀博士，主要研究方向為腸道擬桿菌與宿主健康；膳食多糖與腸道菌群的相互作用；腸道菌群的酶資源挖掘。

02

通信作者

田豐偉，教授、博士、研究生導師。主要從事食品微生物學和食品生物技術領域的教學和科研工作，特別是致力于乳酸菌和益生菌等食品微生物的研究和應用開發工作，先后主持和參與國家自然科學基金項目、江蘇省自然科學基金、國家863計劃、國家科技支撐計劃等國家與省部級研究課題，及參與完成江蘇省高技術研究計劃等縱向和橫向科研項目10余項，7項科研成果通過省部級鑒定，入選2014年江蘇省六大人才高峰計劃。在益生乳酸菌和食品微生物開發領域申請國家發明專利50余項，其中授權發明專利21項，其中美國授權發明專利3項，歐洲授權發明專利1項；在國內外食品生物技術領域學術期刊發表論文52篇，其中SCI論文35篇。先后獲2007年獲教育部高等學校科學技術一等獎，2009年國家科技進步獎二等獎，2014年商業聯合會科技進步一等獎等科研成果獎勵。

Rational protein engineering of thermostable heparinase I from Bacteroides thetaiotaomicron for highly efficient heparin degradation

Chuan Zhanga,b, Ruohan Zhaoa,b, Leilei Yua,b, Qixiao Zhaia,b, Jianxin Zhaoa,b, Hao Zhanga,b, Xuegang Luoc,*, Fengwei Tiana,b,*, Wei Chena,b,d

a State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China

b School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China

c Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology of the Ministry of Education, Tianjin Key Lab of Industrial Microbiology, College of Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China

d National Engineering Research Center for Functional Food, Jiangnan University, Wuxi 214122, China

*Corresponding author.

Abstract

Heparin, a glycosaminoglycan, is a stable source of carbon that supports the growth of microorganisms in the human intestine. It is also a commonly used anticoagulant drug in clinical practice, with significant therapeutic effects. Low molecular weight heparin (LMWH) is a highly active low molecular weight fragment obtained via enzymatic reaction or the chemical degradation of heparin. LMWH has been applied globally in the prevention and treatment of venous thromboembolism in thrombosis patients. Simultaneously, as a potential prebiotic, because of its low molecular weight, LMWH can be well degraded by the gut microbiota to maintain intestinal balance. Enzymatic heparin degradation has recently emerged as a viable disposal method for LMWH preparation; however, only very few benchmark enzymes have been thoroughly described and subjected to protein engineering to improve their properties over the past few years. The commercialization of enzymes will require the development of robustly engineered enzymes that meet the demands of industrial processes. Herein, we report a rational protein engineering strategy that includes molecular dynamic simulations of flexible amino acid mutations and disulfide bond screening. Several Bacteroides thetaiotaomicron heparanase Ⅰ (Bt-HepI) mutants were obtained and screened for high thermal stability. We obtained the Bt-HepID204C/K208C/H189W/Q198R variant, which features a stabilized protein surface structure, with a 1.3-fold increase in catalytic constant/michaelis-menten constant (kcat/Km), a 2.44-fold increase in thermal stability at 50 ℃, and a 1.8-fold decrease in the average molecular weight of LMWH produced at 40 ℃ compared with that seen with Bt-HepIWT. Our study establishes a strategy to engineer thermostable HepI to underpin its industrial applications.

Reference:

ZHANG C, ZHAO R H, YU L L, et al. Rational protein engineering of thermostable heparinase I from Bacteroides thetaiotaomicron for highly efficient heparin degradation[J]. Food Science and Human Wellness, 2025, 14(6): 9250134. DOI:10.26599/FSHW.2024.9250134.

本文編譯內容由作者提供

編輯：梁安琪；責任編輯：孫勇

封面圖片：圖蟲創意

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