FSHW | 次氯酸鈉誘導的可存活但不可培養（VBNC）狀態腸炎沙門菌應激反應的轉錄組與蛋白質組綜合研究

本文系Food Science and Human Wellness原創編譯，歡迎分享，轉載請授權。

01

Introduction

次氯酸鈉（NaClO）因操作簡便、殺菌高效、成本低廉而被廣泛使用，但不當使用可能誘導細菌進入可存活但不可培養（VBNC）狀態。此類細菌雖不能形成菌落，卻仍保持代謝活性，在適宜條件下可復蘇，威脅食品安全與公共衛生。高通量轉錄組與蛋白質組技術為研究細菌應激機制提供了新手段。已有研究揭示了NaClO對腸炎沙門菌的蛋白質組學應答，但對其進入VBNC狀態的條件與適應機制仍缺乏系統認識。本研究旨在探討NaClO誘導腸炎沙門菌（Salmonella Enteritidis）形成VBNC狀態的條件、特征及其應激響應機制，并通過轉錄組與蛋白質組聯合分析進行闡釋。

02

Results and Discussion

次氯酸鈉誘導下腸炎沙門菌進入VBNC狀態

如圖1A所示，當腸炎沙門菌暴露在50 mg/L次氯酸鈉溶液中時，可培養細胞數量迅速下降，而仍存活的細胞數量維持在106～108 cells/mL之間。經過2.5 h處理后，雖然菌落已無法培養，但仍有約61%的細胞保持活性（圖1F），說明大量細胞進入了可存活但不可培養（VBNC）狀態。該濃度與常規食品加工和屠宰環節的消毒水平相當，意味著在常規消毒條件下，部分沙門菌仍可能以VBNC形式存活，并在適宜條件下復蘇。

圖1 腸炎沙門菌在50 mg/L次氯酸鈉作用下0.5～3 h的可培養與可存活細胞變化

VBNC狀態腸炎沙門菌的特征變化

形態變化

掃描電鏡和透射電鏡結果顯示，正常菌體呈規則桿狀、膜結構完整；而VBNC狀態的菌體體積明顯變小，細胞膜出現破裂或不規則形態，甚至部分細胞發生溶解（圖2A–H），表明強氧化環境導致細胞結構受損。

細胞內ROS水平

VBNC菌的活性氧（ROS）含量顯著升高（圖2I），說明氯消毒產生的自由基會在細胞內引發強烈的氧化應激，可能損傷DNA、膜結構和其他生物分子。

NAD?/NADH比例變化

如圖2J所示，VBNC菌的NAD?/NADH比值大幅上升，提示細胞內氧化還原平衡被破壞，能量代謝受抑，處于一種“低代謝休眠”狀態。

ATP含量下降

VBNC細胞的ATP水平由對照組的3.9 nmol/L降至約0.98 nmol/L（圖2K），說明氯處理破壞了能量代謝過程和膜完整性，導致能量耗竭，細胞處于休眠或瀕死狀態。

圖2 VBNC狀態腸炎沙門菌的形態和生理特征變化

氯消毒下VBNC狀態腸炎沙門菌的轉錄組與蛋白質組響應

轉錄組響應

為了深入了解VBNC狀態腸炎沙門菌對氯脅迫的分子適應機制，研究者利用全轉錄組測序分析了其mRNA水平變化。結果顯示，VBNC組與對照組的表達模式差異明顯（圖3A），共有4134個轉錄本發生差異，其中267個基因上調，207個下調。GO富集分析顯示，這些差異基因主要涉及刺激應答、信號傳導及物質轉運等功能（圖3B）。

與對照組相比，VBNC細胞中兩組分系統、生物膜形成、ABC轉運蛋白、分泌系統及鞭毛裝配等相關基因顯著富集（圖3C），說明細胞通過激活這些通路提高環境適應性。同時，與蛋白合成和結構功能相關的基因被下調，反映出細胞降低代謝活性，以維持低能耗的存活狀態。

圖3 VBNC狀態腸炎沙門菌的差異基因分析

蛋白質組響應

為了進一步揭示VBNC狀態下的應激機制，研究者對其蛋白質組進行了分析。結果發現，共檢測到21594條肽段和4464種蛋白，其中1031種顯著差異表達（上調613種，下調418種）（圖4A）。

功能富集結果顯示，這些差異蛋白主要參與應激響應、生物調控、細胞通訊以及能量代謝等過程（圖4B）。KEGG通路分析進一步表明，檸檬酸循環、HIF-1信號通路及糖酵解/糖異生等能量代謝相關途徑被顯著激活（圖4C）。這些變化說明VBNC細胞在受到氯脅迫后，通過調節代謝與信號通路來維持基礎生命活動。

圖4 VBNC狀態腸炎沙門菌的差異蛋白分布及富集分析

轉錄組與蛋白質組關聯分析

基因與蛋白表達的關聯分析顯示，兩者的表達變化并非完全對應（圖5A），這與轉錄后及翻譯后調控有關。盡管如此，二者在多個關鍵通路中呈現共同富集，包括代謝途徑、ABC轉運系統、DNA復制及生物膜形成（圖5B），表明這些通路是細菌維持VBNC狀態的核心環節。

圖5 轉錄組與蛋白質組數據的整合分析

外排泵系統

VBNC狀態下，多種外排泵相關基因顯著上調，其中dppC、lolD、ugpE等ABC外排泵基因提高16～32倍（圖6A）。蛋白質組結果顯示，多藥外排泵蛋白AcrA、TolC、MdtK等也明顯上調，尤其是RND型外排系統AcrAB-TolC及其調控因子ramA上升2倍以上。這些變化表明，VBNC細胞通過增強外排能力，主動排出有毒物質與消毒劑成分，從而保持細胞內部穩定并延長存活時間。

氧化應激反應

VBNC細胞中，氧化應激調控相關基因顯著激活。紅氧敏感轉錄因子SoxR和還原蛋白RseC分別上調4倍與8倍（圖6B），顯示OxyR依賴的氧化防御系統高度活躍。同時，抗氧化蛋白如硫氧還蛋白（TrxA/B）和谷胱甘肽還原蛋白（GrxB/C）顯著上調。

此外，與電子傳遞及氧化還原調控相關的tucA、fadA、apbE、mioC、lldD及NADH-脫氫酶復合體等基因均顯著增強表達，說明細胞通過提高氧化還原活性與抗氧化能力來抵御ROS的破壞。這種應答幫助VBNC細胞在強氧化環境中維持能量代謝平衡和基本生理功能。

圖6 關鍵基因在mRNA和蛋白水平上的表達柱狀圖

DNA修復

VBNC狀態下，腸炎沙門菌的DNA修復系統被顯著激活。SOS反應相關調控因子LexA和RecX的表達分別上升約2倍和4倍，表明SOS修復通路被啟動（圖6C）。LexA調控基因的普遍上調說明細胞正積極應對DNA損傷，相關的修復基因如radA、radC、recO和recN上調幅度達2–16倍。與此同時，核苷酸切除修復基因（uvrA、uvrB、uvrC、uvrD）、DNA錯配修復基因（mutH、mutL、mutS、vsr）及核糖體蛋白基因（rplD、rplM、rplP、rpsP）也顯著上調。

此外，與DNA損傷應答相關的GTP酶（mnmE、typA、RsgA）及DNA依賴ATP酶（RecB、YeaH等）表達升高，進一步說明修復機制處于活躍狀態。蛋白質組結果也驗證了DNA修復相關蛋白（如MutH、MutL、RadA、RadC）的顯著富集?？傮w上，這表明氯消毒造成的DNA損傷超過了細胞常規修復能力，促使細菌啟動SOS及突變型修復機制來維持生存。DNA復制相關蛋白如DnaA與RecF也上調，有助于細胞在受損環境中維持基因復制穩定。

毒力因子

研究發現，VBNC狀態下的腸炎沙門菌仍保持甚至增強了部分致病相關功能。III型分泌系統（T3SS）及其效應蛋白顯著上調，其中sopA、sopB、sspH2、sipA上調2～8倍，結構蛋白SseA與SseL上調約2倍（圖6D）。T3SS作為細菌入侵宿主的重要裝置，可將毒力蛋白直接注入宿主細胞，增強感染能力。

同時，VBNC細胞的鞭毛基因如fliA、fliF、flgA等顯著上調4～32倍，σ28因子（fliA）表達上升約9倍，說明鞭毛生成與運動性增強。這有助于細菌在不利環境下移動、形成生物膜并尋找更適宜的生存區域。黏附相關基因shdA、fimH、sadA、misL也上調4～16倍，蛋白層面上黏附蛋白PagN與FimH上調約2倍，提示其黏附與侵襲能力增強。

更值得關注的是，代謝微結構Eut和Pdu系統顯著上調8～32倍，涉及乙醇胺（Eut）與1,2-丙二醇（Pdu）的利用通路。這些細胞代謝囊泡可包裹有害中間產物，提升代謝效率，使細菌能在腸道缺氧環境中更具生存優勢。相關調控基因arcA、arcB及cAMP-Crp調控因子也同步上升2～8倍，進一步增強能量代謝與適應能力。

這些變化表明，VBNC狀態下的沙門菌可能仍具活躍的代謝與致病潛能，在人體腸道內可能造成更強的感染風險，對食品安全和公共衛生構成潛在威脅。

差異基因與蛋白的表達驗證

為驗證轉錄組與蛋白質組結果的可靠性，研究者隨機選取了8個差異基因和8個差異蛋白進行RT-qPCR和PRM驗證。結果顯示，acrA、arcD、ampG、fadA、pduL、radC、soxR等基因的表達趨勢與RNA-seq結果一致（圖5C），蛋白質組的PRM驗證結果也與原始數據相符（圖5D），說明本研究的多組學分析數據具有較高可靠性。

03

Conclusion

本研究結合轉錄組與蛋白質組分析，系統揭示了氯消毒誘導的VBNC狀態腸炎沙門菌的適應機制。結果表明，這些細胞通過多種應激途徑應對氧化損傷與環境壓力，包括DNA修復、SOS反應、氧化應激防御、多藥外排系統（RND）以及III型分泌系統（T3SS）。同時，鞭毛和代謝囊泡（Eut與Pdu BMCs）的增強表達可能進一步提升其致病性與腸道生存能力。

研究提示，氯消毒可能無法徹底清除沙門菌VBNC細胞，這類細胞仍具潛在感染風險，亟需制定更科學、徹底的消毒策略，以降低其對食品與公共健康的威脅。

An integrated transcriptome and proteomic investigation of the stress responses of viable but non-culturable (VBNC) state Salmonella Enteritidis triggered by sodium hypochlorite

Wen Wanga,b,1, Wensi Wangb,c,1, Zhengkai Yib, Jiele Mab, Wenfu Houc, Yingping Xiaob, Hua Yangb, Hongxun Wangc,*, Xingning Xiaob,*

a Key Laboratory of Microbiological Metrology, Measurement & Bio-product Quality Security, State Administration for Market Regulation, College of Life Sciences, China Jiliang University, Hangzhou 310018, China

b State Key Laboratory for Managing Biotic and Chemical Threats to the Quality and Safety of Agro-products, MOA Laboratory of Quality & Safety Risk Assessment for Agro-products (Hangzhou), Institute of Agro-product Safety and Nutrition, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China

c College of Food Science and Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China

1 Both authors contributed equally.

*Corresponding author.

Abstract

Viable but non-culturable (VBNC) bacteria after chlorination disinfection pose a considerable threat to the public health and environment. The current work aimed to uncover the stress adaptation mechanisms of VBNC Salmonella Enteritidis to sodium hypochlorite. In this study, we investigated the morphology, gene expressions and proteomic profile in VBNC S. Enteritidis. It demonstrated that 109 cells/mL of bacteria could transition into the VBNC state after exposure to 50 mg/L chlorine for 2.5 h. The VBNC state cells exhibited cellular membrane impairment, decreased size, and intracellular ATP depletion compared to the culturable cells. In the VBNC state cells, there was a significant increase in intracellular reactive oxygen species (ROS) levels and NAD+/NADH ratios. This observation suggested an imbalance in the intracellular redox status of the VBNC bacteria. Transcriptome and proteomic analysis revealed significant upregulation of the resistance-nodulation-division (RND) efflux systems (arcA, tolC, ramA), oxidative stress response genes (soxR, trxA, grxB), DNA repair genes (lexA, radA, mutH, mutL), and virulence factor genes (sseA, sseL, eutS, and eutE). Our findings indicated that it is important to formulate disinfection protocols that are specifically designed for food processing plants and healthcare facilities, focusing on implementing a more thorough disinfection method to effectively eradicate VBNC cells.

Reference:

WANG W, WANG W S, YI Z K, et al. An integrated transcriptome and proteomic investigation of the stress responses of viable but non-culturable (VBNC) state Salmonella Enteritidis triggered by sodium hypochlorite[J]. Food Science and Human Wellness, 2025, 14(5): 9250213. DOI:10.26599/FSHW.2024.9250213.

翻譯：王小云（實習）

編輯：梁安琪；責任編輯：孫勇

封面圖片：圖蟲創意

為匯聚全球智慧共探產業變革方向，搭建跨學科、跨國界的協同創新平臺，由北京食品科學研究院、中國肉類食品綜合研究中心、國家市場監督管理總局技術創新中心（動物替代蛋白）、中國食品雜志社《食品科學》雜志（EI收錄）、中國食品雜志社《Food Science and Human Wellness》雜志（SCI收錄）、中國食品雜志社《Journal of Future Foods》雜志（ESCI收錄）主辦，西南大學、 重慶市農業科學院、 重慶市農產品加工業技術創新聯盟、重慶工商大學、重慶三峽學院、西華大學、成都大學、四川旅游學院、北京聯合大學、 中國-匈牙利食品科學“一帶一路”聯合實驗室（籌）共同主辦 的“ 第三屆大食物觀·未來食品科技創新國際研討會 ”， 將于2026年4月25-26日 （4月24日全天報到） 在中國 重慶召開。

長按或微信掃碼進行注冊

為系統提升我國食品營養與安全的科技創新策源能力，加速科技成果向現實生產力轉化，推動食品產業向綠色化、智能化、高端化轉型升級，由北京食品科學研究院、中國食品雜志社《食品科學》雜志（EI收錄）、中國食品雜志社《Food Science and Human Wellness》雜志（SCI收錄）、中國食品雜志社《Journal of Future Foods》雜志（ESCI收錄）主辦，合肥工業大學、安徽農業大學、安徽省食品行業協會、安徽大學、合肥大學、合肥師范學院、北京工商大學、中國科技大學附屬第一醫院臨床營養科、安徽糧食工程職業學院、安徽省農科院農產品加工研究所、安徽科技學院、皖西學院、黃山學院、滁州學院、蚌埠學院共同主辦的“第六屆食品科學與人類健康國際研討會”，將于 2026年8月15-16日（8月14日全天報到）在中國 安徽 合肥召開。

長按或微信掃碼進行注冊

會議招商招展

聯系人：楊紅；電話：010-83152138；手機：13522179918（微信同號）