FSAP | 寧波大學涂茂林副教授等：從酪蛋白中鑒定一種安全有效的抗氧化肽：體外與細胞水平研究

寧波大學農產品質量安全全國重點實驗室、食品科學與工程學院、全省食品微生物與營養健康重點實驗室、“浙江—馬來西亞農產品加工與營養健康聯合實驗室范碩等從牛酪蛋白中篩選出一種新型抗氧化肽，重點研究其體外抗氧化能力及對氧化損傷HepG2細胞的保護作用，該肽表現出有效的2,2′-聯氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽離子自由基和活性氧（reactive oxygen species，ROS）清除能力。這一研究為功能食品和藥品的開發提供了科學依據。

Introduction

自由基是機體正常代謝產生的生理反應產物，包括ROS和活性氮等。其動態平衡通過酶系統和抗氧化劑的協同作用得以維持。然而，當多種內外不利因素共同作用時，可能破壞這一調控系統，導致自由基過量產生。這些高活性分子會進一步誘發氧化應激，顯著增加患炎癥、糖尿病、高血壓等疾病風險。此時外源性補充抗氧化劑尤為重要。然而，丁基羥基甲苯、丁基羥基茴香醚等合成化合物雖具有優異的自由基清除活性，但可能對肝臟、肺部等器官造成不良反應；而VC、VE等天然抗氧化劑則往往受限于高成本和不穩定性。因此，尋找新型天然抗氧化劑尤為重要。

越來越多的研究表明，生物活性肽具有特異性強、來源廣泛、副作用小等突出優勢，在醫療健康領域展現出廣闊的應用前景。目前在肉類、乳及乳制品、豆類堅果及谷物等多種食品原料中均已鑒定出抗氧化肽。酪蛋白約占牛乳總蛋白含量的80%，同樣是抗氧化肽的重要來源。

Results

1酪蛋白水解物的分子質量分布及高效液相色譜-串聯質譜法（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）

酪蛋白水解物的分子質量分布及肽段組成特征分析如圖1所示。＜3 kDa的組分占比較小（通常分子質量＜3 kDa的生物活性肽具有更高抗氧化活性），提示需進一步優化酶解條件以提高小分子肽占比，從而增強整體抗氧化活性；肽段組成特征顯示，3～26肽段數量占主導地位（分子質量主要＜3 kDa），這與分子質量分布結果并不矛盾，因為HPLC-MS/MS技術對高分子質量肽段的檢測存在局限性。

A.酪蛋白水解物的分子質量分布；B. HPLC-MS/MS鑒定出的肽長度和肽個數的關系。

圖1酪蛋白水解物的分子質量分布及肽段組成特征分析

2酪蛋白水解物及肽VRYL的體外抗氧化活性

酪蛋白水解物的抗氧化活性如圖2A、B所示。其抗氧化能力隨質量濃度增加而增強，ABTS陽離子自由基清除能力的IC50約為3.00 mg/mL，Fe2+螯合能力在1.5 mg/mL時達84.04%，具有較好的抗氧化能力，可能通過提供電子/氫原子及抑制Fenton反應發揮抗氧化作用。

肽VRYL的ABTS陽離子自由基清除活性如圖2C所示，IC50為0.36 mg/mL，具有良好的抗氧化活性，其活性可能源于Tyr的酚羥基供氫作用及Val/Leu疏水側鏈的穩定效應。

A.酪蛋白水解物的ABTS陽離子自由基清除率；B.酪蛋白水解物的Fe2+螯合能力；C.肽VRYL的ABTS陽離子自由基清除率。

圖2酪蛋白水解物和肽VRYL的抗氧化活性

3酪蛋白水解物及肽VRYL的安全性分析

酪蛋白水解物和肽VRYL的細胞毒性和溶血實驗如圖3～4所示。在實驗濃度下，酪蛋白水解物和肽VRYL處理后，RAW264.7的存活率都在100%左右；溶血率都低于5%。表明酪蛋白水解物和肽VRYL都具有高安全性。

A.酪蛋白水解物對RAW264.7細胞的活性影響；B～D.酪蛋白水解物的溶血實驗。

圖3酪蛋白水解物的安全性

A.肽VRYL對RAW264.7細胞的活性影響；B～D.肽VRYL的溶血實驗。

圖4肽VRYL的安全性評估

4肽VRYL的細胞內抗氧化活性

相比于H2O2處理組，通過肽VRYL的保護，HepG2細胞內的ROS含量顯著降低，這表明肽VRYL在細胞水平上具有抗氧化作用。

A1.對照組；A2. H2O2處理組；A3～A6.分別為0.075、0.1、0.25、0.5 mg/mL VRYL處理組；B.不同處理組細胞的相對熒光強度。

圖5肽VRYL對HepG2細胞中ROS含量的影響

Conclusion

本研究通過酶解法制備了酪蛋白水解物，并對其安全性和抗氧化性進行了評估。結果表明，酪蛋白水解物具有顯著的ABTS陽離子自由基清除能力、Fe2+螯合能力和較高的生物安全性。通過計算機技術，篩選得到一種新型肽VRYL，它不僅具有良好的ABTS陽離子自由基清除能力，還能顯著降低H2O2誘導的HepG2細胞模型中的ROS含量，這表明肽VRYL對氧化應激具有良好的保護作用。本研究有望為抗氧化肽的開發和應用提供理論依據。

Abstract

This study aimed to investigate the antioxidant potential of bovine casein hydrolysate and a pure peptide screened from it. The casein hydrolysate obtained by pepsin digestion exhibited obvious antioxidant activity in vitro, including potent Fe2+ chelating and 2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) cation radical scavenging activities. A novel tetrapeptide, VRYL, was predicted and successfully characterized using in silico techniques and showed excellent ABTS cation radical scavenging ability, with a half maximal inhibitory concentration of 0.36 mg/mL, which is significantly lower than that of the original hydrolysate. Moreover, at the cellular level, VRYL effectively protected against H2O2-induced oxidative stress damage in HepG2 cells and significantly reduced intracellular reactive oxygen species levels. The peptide VRYL not only exhibited excellent antioxidant capacity in vitro but also demonstrated its ability to mitigate oxidative stress damage in a cellular model. This study provides a new theoretical basis for the development of casein hydrolysates and their derived peptides in functional foods.

引文格式

Fan S, Yang X, Wang J, et al. Identification of a safe and effective antioxidant peptide from casein:

in vitro

作者介紹

涂茂林副教授

寧波大學食品科學與工程學院

涂茂林，女，寧波大學食品科學與工程學院副教授，碩士生導師，寧波市領軍拔尖人才，主要從事食源性功能因子挖掘及活性機制分析和益生菌鑒定及包埋遞送相關研究。目前，共發表SCI文章50余篇，其中第一作者/通信作者SCI論文25 篇，其他文章5篇，包含1 篇ESI高被引文章；個人H-Index為25；主持6 項國家和省市級基金。申請國家發明專利11 項；擔任國際期刊《Food Science of Animal Products》青年編委，《Frontiers in Nutrition》的客座編輯，《Critical Reviews in Food Science and Nutrition》和《Food Chemistry》等期刊審稿人。

范碩碩士研究生

寧波大學食品科學與工程學院

范碩，22級碩士研究生，現就讀于寧波大學食品科學與工程學院，主要研究方向為生物活性肽的高效鑒定和作用機制分析。讀研期間，以第一作者在《International Journal of Biological Macromolecules》《Current Research in Food Science》和《Food Science of Animal Products》期刊上發表論文3 篇；申請國家發明專利1 項，參與校級學生科研項目3 項。

文章內容由作者團隊提供。

編輯：閻一鳴； 責任編輯：劉莉

為匯聚全球智慧共探產業變革方向，搭建跨學科、跨國界的協同創新平臺，由北京食品科學研究院、中國肉類食品綜合研究中心、國家市場監督管理總局技術創新中心（動物替代蛋白）、中國食品雜志社《食品科學》雜志（EI收錄）、中國食品雜志社《Food Science and Human Wellness》雜志（SCI收錄）、中國食品雜志社《Journal of Future Foods》雜志（ESCI收錄）主辦，西南大學、 重慶市農業科學院、 重慶市農產品加工業技術創新聯盟、重慶工商大學、重慶三峽學院、西華大學、成都大學、四川旅游學院、北京聯合大學、 中國-匈牙利食品科學“一帶一路”聯合實驗室（籌） 共同主辦 的“ 第三屆大食物觀·未來食品科技創新國際研討會 ”， 將于2026年4月25-26日 （4月24日全天報到） 在中國 重慶召開。

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為系統提升我國食品營養與安全的科技創新策源能力，加速科技成果向現實生產力轉化，推動食品產業向綠色化、智能化、高端化轉型升級，由北京食品科學研究院、中國食品雜志社《食品科學》雜志（EI收錄）、中國食品雜志社《Food Science and Human Wellness》雜志（SCI收錄）、中國食品雜志社《Journal of Future Foods》雜志（ESCI收錄）主辦，合肥工業大學、安徽農業大學、安徽省食品行業協會、安徽大學、合肥大學、合肥師范學院、北京工商大學、中國科技大學附屬第一醫院臨床營養科、安徽糧食工程職業學院、安徽省農科院農產品加工研究所、安徽科技學院、皖西學院、黃山學院、滁州學院、蚌埠學院共同主辦的“第六屆食品科學與人類健康國際研討會”，將于 2026年8月15-16日（8月14日全天報到）在中國 安徽 合肥召開。

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