脂質(zhì)納米顆粒核酸遞送的六十年演變

引言

1958年，F(xiàn)rancis Crick提出了分子生物學(xué)的中心法則，指出遺傳信息從DNA流向RNA再流向蛋白質(zhì)。隨后，Alexand及其同事發(fā)現(xiàn)高鹽濃度可增強(qiáng)病毒RNA的低感染力，此后利用堿性蛋白和DEAE葡聚糖等轉(zhuǎn)染方法顯著提高了感染力。1973年，磷酸鈣-DNA共沉淀法被證明能進(jìn)一步提高純化病毒DNA的感染力。隨著重組DNA技術(shù)的發(fā)展，將鈣磷酸鹽和DEAE葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法應(yīng)用于重組質(zhì)粒在培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的遞送和表達(dá)，促進(jìn)了基因工程的發(fā)展。

早期關(guān)于體內(nèi)基因遞送的研究表明，注射含有病毒基因組的“裸”質(zhì)?？赡軐?dǎo)致感染。例如，1979年證實(shí)多瘤病毒質(zhì)粒DNA在親代給藥后對(duì)小鼠和倉(cāng)鼠具有感染性。然而，裸質(zhì)?；蜻f送方法的臨床應(yīng)用受到限制，歸因于轉(zhuǎn)染效率低下以及DNA隨機(jī)自發(fā)整合入人類基因組等問(wèn)題。與此同時(shí)，使用病毒載體的基因療法常與免疫反應(yīng)相關(guān)，這雖然對(duì)體細(xì)胞基因治療不利，卻促進(jìn)了基于病毒載體的疫苗開(kāi)發(fā)。核酸疫苗相比經(jīng)典疫苗具有重要優(yōu)勢(shì)，其合成的蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)被分解并通過(guò)MHC I類分子呈遞，激活CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞，從而刺激細(xì)胞免疫。

目前大多數(shù)正在開(kāi)發(fā)的基因療法使用病毒遞送系統(tǒng)，如腺相關(guān)病毒載體，但其在遺傳容量、免疫原性和制造方面面臨阻礙。相比之下，非病毒脂質(zhì)基遞送系統(tǒng)如脂質(zhì)納米顆粒，因其在安全性、耐受性、可重復(fù)給藥、大遺傳載荷、易于設(shè)計(jì)和制造等方面的優(yōu)勢(shì)，可能會(huì)成為主導(dǎo)。

一、脂質(zhì)體與脂質(zhì)復(fù)合物的早期研究

1. 脂質(zhì)體的發(fā)現(xiàn)與表征

1964年，人們發(fā)現(xiàn)卵磷脂在水性介質(zhì)中的分散體產(chǎn)生了由同心脂質(zhì)雙層組成的多層系統(tǒng)，這支持了脂質(zhì)在生物膜中提供滲透性屏障的提議。這一發(fā)現(xiàn)引發(fā)了表征脂質(zhì)生物物理特性及其在膜中功能角色的密集研究。脂質(zhì)體一詞通常被理解為指代由脂質(zhì)以雙層結(jié)構(gòu)組織而成的納米或微米級(jí)顆粒的水性分散體。多種制劑方法被開(kāi)發(fā)出來(lái)，包括1969年的超聲處理、1973年的乙醇注入法、1979年的擠壓法等，以產(chǎn)生不同大小和結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體。

早期致力于生成包含核酸的脂質(zhì)體系統(tǒng)，始于1977年發(fā)現(xiàn)mRNA可被封裝于通過(guò)乙醇制劑技術(shù)產(chǎn)生的脂質(zhì)體中。1982年，使用非感染性重組質(zhì)粒DNA的體內(nèi)基因遞送和表達(dá)得到證實(shí)，顯示脂質(zhì)體封裝的含有大鼠前胰島素原基因的pDNA在靜脈給藥后可在體內(nèi)表達(dá)。然而，這些研究受到封裝效率低、表達(dá)水平低和無(wú)法規(guī)模化制劑工藝的限制。例如，脂質(zhì)體在水性介質(zhì)中的捕獲體積僅占總水性體積的一小部分，因此通過(guò)“被動(dòng)”封裝過(guò)程進(jìn)行的DNA和mRNA封裝效率很低。此外，帶有負(fù)電荷表面的脂質(zhì)體排斥帶負(fù)電荷的核酸，也抑制了封裝。

2. 陽(yáng)離子脂質(zhì)與脂質(zhì)復(fù)合物的突破

1987年，F(xiàn)elgner假設(shè)帶正電荷的脂質(zhì)體可能提供一種增強(qiáng)帶負(fù)電荷核酸聚合物封裝效率的方法?；谥|(zhì)體研究的設(shè)計(jì)原則，合成了一系列陽(yáng)離子脂質(zhì)分子，其中N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨（DOTMA）是主要例子。當(dāng)DOTMA與等摩爾水平的“輔助”脂質(zhì)如DOPC或DOPE混合并分散在水性介質(zhì)中時(shí)，會(huì)產(chǎn)生非常小、穩(wěn)定、帶正電荷的脂質(zhì)體。當(dāng)這些脂質(zhì)體與pDNA混合時(shí)，可以形成大小和形態(tài)各異的“脂質(zhì)復(fù)合物”。

脂質(zhì)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)敏感于所用輔助脂質(zhì)的相偏好。當(dāng)輔助脂質(zhì)為DOPC時(shí)，核酸似乎被夾在同心脂質(zhì)雙層之間。相反，當(dāng)輔助脂質(zhì)為DOPE時(shí)，低角X射線散射和電子顯微鏡顯示核酸被包含在脂質(zhì)以無(wú)序六角HII相形成的親水管中。這種脂質(zhì)復(fù)合物代表了相較于以往轉(zhuǎn)染方案的重要封裝進(jìn)步，也是通過(guò)合理設(shè)計(jì)構(gòu)建具有轉(zhuǎn)染能力的納米顆粒的潛在起點(diǎn)。

脂質(zhì)復(fù)合物無(wú)需添加額外功能基團(tuán)即可將pDNA和mRNA高效轉(zhuǎn)染至培養(yǎng)細(xì)胞中。研究發(fā)現(xiàn)，在陽(yáng)離子脂質(zhì)體中摻入等摩爾水平的偏好HII相的脂質(zhì)DOPE可提高轉(zhuǎn)染效率，這與其在膜融合事件中的作用一致，可能與增強(qiáng)脂質(zhì)復(fù)合物與內(nèi)體膜之間的融合事件有關(guān)。相反，摻入偏好雙層的脂質(zhì)DOPC則抑制轉(zhuǎn)染。如今，DOTMA–DOPE轉(zhuǎn)染試劑在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中得到廣泛應(yīng)用。

Vical公司致力于開(kāi)發(fā)陽(yáng)離子脂質(zhì)制劑的體內(nèi)基因遞送應(yīng)用。初步研究表征了脂質(zhì)復(fù)合物DNA和mRNA直接注射入小鼠組織（包括肌肉）后的基因表達(dá)。骨骼肌中觀察到高基因表達(dá)水平。值得注意的是，即使是不含陽(yáng)離子脂質(zhì)的“裸DNA”對(duì)照組，其基因表達(dá)水平也與含陽(yáng)離子脂質(zhì)的組相當(dāng)。這一意外發(fā)現(xiàn)確立了Vical在裸DNA基因治療和疫苗領(lǐng)域的領(lǐng)導(dǎo)地位。隨后觀察到的高轉(zhuǎn)染水平被歸因于壓力誘導(dǎo)效應(yīng)，使大分子能夠通過(guò)肌肉細(xì)胞膜的暫時(shí)性破裂通過(guò)。

二、脂質(zhì)納米顆粒遞送系統(tǒng)的演變

脂質(zhì)納米粒子系統(tǒng)的演變建立在對(duì)雙層脂質(zhì)體系統(tǒng)的理解之上，但也嚴(yán)重依賴于脂質(zhì)多態(tài)性和脂質(zhì)不對(duì)稱性的基礎(chǔ)研究，以及開(kāi)發(fā)抗癌藥物脂質(zhì)體制劑的經(jīng)驗(yàn)。

1. 脂質(zhì)多態(tài)性與不對(duì)稱性的啟示

脂質(zhì)多態(tài)性是指生物膜中很大比例的脂質(zhì)在水性介質(zhì)中優(yōu)先采用非雙層結(jié)構(gòu)如六角HII相的有趣發(fā)現(xiàn)。1978年，Cullis和Hope提出非雙層脂質(zhì)在提供膜融合所需的中間結(jié)構(gòu)中具有直接作用。2001年發(fā)現(xiàn)，將陽(yáng)離子脂質(zhì)與生物膜中發(fā)現(xiàn)的帶負(fù)電荷的雙層形成脂質(zhì)混合會(huì)導(dǎo)致HII相結(jié)構(gòu)的形成。這一發(fā)現(xiàn)與陽(yáng)離子脂質(zhì)破壞生物膜中雙層結(jié)構(gòu)以實(shí)現(xiàn)核酸貨物細(xì)胞內(nèi)遞送的能力一致。

脂質(zhì)不對(duì)稱性研究也為L(zhǎng)NP核酸遞送系統(tǒng)的發(fā)展提供了必要的見(jiàn)解和工具。這些研究始于確定生物膜中觀察到的脂質(zhì)不對(duì)稱跨雙層分布的后果，并表明pH梯度可調(diào)節(jié)脂質(zhì)囊泡中弱堿和弱酸脂質(zhì)的跨雙層分布。隨后的工作集中在理解影響雙層囊泡系統(tǒng)間膜融合的因素，顯示可離子化陽(yáng)離子脂質(zhì)的摻入可響應(yīng)pH梯度產(chǎn)生脂質(zhì)不對(duì)稱性。此外，PEG脂質(zhì)對(duì)膜融合的影響研究表明，短鏈（C14）PEG脂質(zhì)可從囊泡解離從而允許融合進(jìn)行。這些概念對(duì)于開(kāi)發(fā)有效的LNP siRNA和mRNA遞送系統(tǒng)至關(guān)重要。

2. 小分子藥物脂質(zhì)體制劑的經(jīng)驗(yàn)

開(kāi)發(fā)小分子藥物脂質(zhì)體制劑所獲得的見(jiàn)解為設(shè)計(jì)基因治療LNPs提供了重要指導(dǎo)。1986年，隨著脂質(zhì)體制備和載藥的可擴(kuò)展程序的開(kāi)發(fā)，旨在更準(zhǔn)確地將小分子遞送至疾病部位的研究正式開(kāi)始。擠壓技術(shù)被證明適用于生產(chǎn)直徑100 nm或更小的脂質(zhì)體系統(tǒng)。隨后發(fā)現(xiàn)了可擴(kuò)展的pH“遠(yuǎn)程裝載”技術(shù)用于將弱堿藥物裝載入脂質(zhì)體。PEG涂層賦予脂質(zhì)體系統(tǒng)長(zhǎng)循環(huán)半衰期，使其能優(yōu)先分布至腫瘤部位。這些工作導(dǎo)致FDA批準(zhǔn)了十余種脂質(zhì)體產(chǎn)品，主要含有抗癌藥物。學(xué)到的主要教訓(xùn)是，脂質(zhì)體系統(tǒng)必須?。ㄖ睆?lt;100 nm）、長(zhǎng)循環(huán)，并由促進(jìn)長(zhǎng)循環(huán)半衰期的脂質(zhì)組成。

3. 穩(wěn)定化核酸脂質(zhì)顆粒（SNALP）的開(kāi)發(fā)

1990年代中期，Inex Pharmaceuticals和UBC的合作致力于開(kāi)發(fā)脂質(zhì)基核酸遞送系統(tǒng)，使其在靜脈注射后能表現(xiàn)出到達(dá)腫瘤等疾病部位所需的長(zhǎng)循環(huán)半衰期。含有永久帶正電荷陽(yáng)離子脂質(zhì)的脂質(zhì)基系統(tǒng)因激活補(bǔ)體并被迅速清除而不理想。因此，努力轉(zhuǎn)向開(kāi)發(fā)在生理pH值下凈中性電荷的遞送系統(tǒng)。

1999年開(kāi)發(fā)了第一個(gè)此類系統(tǒng)，稱為穩(wěn)定化質(zhì)粒脂質(zhì)顆粒（SPLP），使用少量陽(yáng)離子脂質(zhì)DODAC和PEG脂質(zhì)通過(guò)洗滌劑透析法制備。PEG脂質(zhì)的存在對(duì)于防止制劑過(guò)程中的聚集是必要的。靜脈給藥的SPLP顯示出比復(fù)合物明顯更長(zhǎng)的循環(huán)壽命和更低毒性。隨后的研究表明，含有短鏈PEG脂質(zhì)的SPLP配方能調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)染特性，這可能歸因于其從脂質(zhì)基系統(tǒng)解離的能力。

2001年，展示了利用最初為脂質(zhì)不對(duì)稱性研究開(kāi)發(fā)的可離子化陽(yáng)離子脂質(zhì)DODAP，將反義寡核苷酸封裝入脂質(zhì)基系統(tǒng)（SALP）。研究表明，在pH值低于可離子化脂質(zhì)pKa的條件下混合核酸聚合物與含有可離子化陽(yáng)離子脂質(zhì)的脂質(zhì)體，它們應(yīng)因可離子化脂質(zhì)的正電荷而結(jié)合。隨后利用T型管混合器進(jìn)行乙醇中脂質(zhì)與pH 4緩沖液中pDNA的快速混合，產(chǎn)生了小型帶正電荷囊泡，隨后與帶負(fù)電荷DNA結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了無(wú)需擠壓的可擴(kuò)展方法。

為了增強(qiáng)脂質(zhì)載體與內(nèi)體膜融合的可能性，利用陽(yáng)離子脂質(zhì)與內(nèi)源性陰離子脂質(zhì)結(jié)合誘導(dǎo)膜破壞性HII相的觀察，設(shè)計(jì)了可離子化陽(yáng)離子脂質(zhì)DLinDMA。在此基礎(chǔ)上，Protiva與Alnylam合作，將設(shè)計(jì)用于沉默ApoB的siRNA封裝入稱為穩(wěn)定化核酸脂質(zhì)粒子（SNALP）的SALP版本中。盡管觀察到小鼠和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物中ApoB的減少，但配方的效力或治療指數(shù)不足以進(jìn)行臨床開(kāi)發(fā)。

4. LNP技術(shù)的優(yōu)化與臨床轉(zhuǎn)化

2010年，報(bào)道了通過(guò)優(yōu)化可離子化脂質(zhì)成分的頭基，可顯著改善LNP siRNA配方的基因沉默效力。此時(shí)，SPLP、SALP和SNALP等配方被描述為L(zhǎng)NPs家族的一部分。這些系統(tǒng)不能被稱為脂質(zhì)體，因?yàn)樗鼈兛杀憩F(xiàn)出納米結(jié)構(gòu)的疏水內(nèi)部。改善效力的理性假設(shè)是，當(dāng)可離子化陽(yáng)離子脂質(zhì)在被攝取入肝細(xì)胞后的內(nèi)體低pH環(huán)境中質(zhì)子化時(shí)，它們與內(nèi)源性陰離子脂質(zhì)結(jié)合，通過(guò)形成膜破壞性非雙層中間體引發(fā)融合，從而使核酸釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。DLinKC2DMA被鑒定為更有效的可離子化脂質(zhì)。2012年，DLinMC3DMA被鑒定為主要可離子化脂質(zhì)，其pKa被證明是LNP活性的關(guān)鍵決定因素，最活躍的脂質(zhì)表現(xiàn)出pKa為6.4。

次年，健康志愿者的I期臨床試驗(yàn)顯示，含有DLinMC3DMA和siRNA的LNP系統(tǒng)在肝臟中引起快速且強(qiáng)效的轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白下調(diào)。隨后的III期臨床試驗(yàn)在治療轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白誘導(dǎo)的淀粉樣變性方面取得了優(yōu)異結(jié)果，導(dǎo)致FDA于2018年批準(zhǔn)Onpattro。Onpattro現(xiàn)已給藥部分患者長(zhǎng)達(dá)10年，未報(bào)告因累積效應(yīng)引起的不良事件。

值得注意的是，用于封裝和遞送siRNA的封裝工藝和脂質(zhì)成分也可應(yīng)用于更大的RNA分子。2012年證明，為siRNA遞送開(kāi)發(fā)的LNP也可用于封裝編碼呼吸道合胞病毒F蛋白的自擴(kuò)增RNA，并在小鼠肌肉注射后觀察到強(qiáng)效且保護(hù)性的免疫反應(yīng)。隨后2015年研究表明，編碼促紅細(xì)胞生成素的mRNA可封裝入LNP系統(tǒng)，靜脈給藥后在豬模型中導(dǎo)致循環(huán)中高水平促紅細(xì)胞生成素

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三、LNP mRNA疫苗與治療藥物的影響

COVID-19 LNP mRNA疫苗具有改變世界的影響力，僅2021年就估計(jì)挽救了近1000萬(wàn)人的生命。這一影響力正被其他依賴LNP遞送系統(tǒng)的RNA療法的潛在臨床應(yīng)用日益超越。目前有超過(guò)60種使用LNP遞送技術(shù)的疫苗和治療藥物已獲批或正在臨床開(kāi)發(fā)中。

目前可用的LNP技術(shù)正用于治療可利用肝臟靶點(diǎn)的廣泛疾病，包括心血管疾病、肝纖維化和罕見(jiàn)疾病如丙酸血癥。LNP介導(dǎo)的基因編輯方法在肝臟中失能致病基因具有巨大潛力。例如，一項(xiàng)通過(guò)LNP介導(dǎo)的PCSK9堿基編輯預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的治療已在臨床上得到證明。

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結(jié)語(yǔ)

LNP系統(tǒng)在遞送基于核酸的疫苗和治療藥物方面的巨大成功正在開(kāi)啟新一代基因療法。這些系統(tǒng)在遺傳容量、可重復(fù)給藥、可擴(kuò)展性、易于制造、低成本以及高度個(gè)性化靶向治療的潛力方面表現(xiàn)出壓倒性的優(yōu)勢(shì)。LNP遞送系統(tǒng)賦能的基因療法的前景顯然是變革性的。

參考文獻(xiàn)：

The 60-year evolution of lipid nanoparticles for nucleic acid delivery. Nat Rev Drug Discov. 2024 Sep;23(9):709-722.

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