FSAP |?加拿大阿爾伯塔大學吳建平教授等：水溶性蛋黃水解物具有破骨細胞生成抑制作用

加拿大阿爾伯塔大學Ilekuttige Priyan Shanura Fernando等假設蛋黃鹽溶性水解組分（salt-soluble hydrolyzed egg yolk fraction，FC）對破骨細胞形成與分化具有劑量依賴性抑制作用，旨在深入探究其作用機制，為開發改善骨骼健康的功能性食品成分提供依據。

Introduction

骨骼通過成骨細胞與破骨細胞的協同作用持續進行重塑，二者功能失衡會引發骨骼疾病。骨質疏松癥作為常見骨骼疾病，以骨密度降低、骨組織脆弱及骨折風險升高為特征，全球50 歲及以上人群中男性患病率達4.2%、女性達18.8%，未來發病率還將大幅上升。目前臨床治療手段包括雙膦酸鹽、地舒單抗等藥物及非藥物干預，但存在副作用風險，因此食品來源的生物活性化合物因安全性高、副作用少，成為研究熱點。

生物活性肽可通過多種細胞信號通路促進成骨活性、抑制破骨細胞生成，其中蛋黃來源肽表現突出——蛋黃肽已被證實可體外促進成骨細胞增殖分化，還能提高去卵巢（ovariectomized，OVX）骨質疏松大鼠模型的骨密度；蛋黃水溶性部分中的卵黃高磷蛋白（含123 個磷酸絲氨酸殘基，是已知磷酸化程度最高的天然蛋白）及其衍生磷酸肽（phosphopeptides，PPP），可增強鈣結合能力、促進鈣在骨骼中沉積，進而促進骨形成、抑制骨吸收。

然而，蛋黃來源肽及其他成分發揮生物活性的具體機制仍不明確，且提取純化過程耗時耗力、成本高，制約了規模化生產。此前研究已制備出3 種蛋黃組分：水溶性組分（water-soluble egg yolk fraction，FA）、鹽溶性組分（salt-soluble egg yolk fraction，FB）及FC，發現FC及其亞組分FC1（＜3 kDa）可通過調節核因子-κB配體受體激活劑（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）/骨保護素（osteoprotegerin，OPG）比值，促進成骨細胞增殖、分化、遷移及礦化，同時抑制破骨細胞生成。

Results

1蛋黃組分對破骨細胞生成、MAPK通路及破骨細胞生成因子的抑制作用

破骨細胞形成抑制：以具有已知破骨細胞生成抑制作用的卵轉鐵蛋白（ovotransferrin，OVT）為陽性對照，在RANKL誘導的RAW264.7細胞模型中，FA、FB、FC 3 種蛋黃組分均以劑量依賴性方式抑制破骨細胞形成。其中，1000 μg/mL FA、100～1000 μg/mL FB及100～1000 μg/mL FC抑制效果顯著；相同劑量（1000 μg/mL）下，FC的抑制作用顯著強于FA和FB，且與OVT相當。

MAPK通路抑制：RANKL誘導破骨細胞生成時會激活MAPK通路（含ERK、p38、JNK 3 種關鍵激酶），1000 μg/mL FC可顯著抑制RANKL誘導的p38和JNK磷酸化，阻斷通路激活。

破骨細胞生成因子調控：RANKL會顯著上調破骨細胞生成關鍵蛋白（TRAF6、c-Fos、NFATc1、組織蛋白酶K）的表達，而FC預處理可劑量依賴性降低這些蛋白的表達水平，高劑量時處理組與未處理組差異顯著，表明FC通過抑制MAPK信號及破骨細胞特異性蛋白生成，實現對破骨細胞形成與分化的抑制。

A. TRAP染色圖像；B.成熟破骨細胞計數；C. MAPK通路介質的相對磷酸化水平；D.破骨細胞生成標志物的蛋白水平。

圖1蛋黃組分對RANKL誘導的破骨細胞形成的抑制作用及FC對MAPK通路和破骨細胞生成因子調節的影響

2 FC亞組分（FC1、FC2）對破骨細胞分化的抑制差異

通過3 kDa截留超濾膜將FC分為FC1（＜3 kDa）和FC2（＞3 kDa），二者均以劑量依賴性方式抑制RANKL誘導的RAW264.7細胞向破骨細胞分化（表現為抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）陽性多核細胞減少），但FC1抑制活性更強：100～1000 μg/mL FC1抑制效果顯著，1000 μg/mL時TRAP陽性破骨細胞占比僅為（53.33±9.73）%；而FC2僅在1000 μg/mL 時抑制效果顯著，TRAP陽性破骨細胞占比為（84.00±5.11）%。免疫熒光染色（小麥胚芽凝集素＋Hoechst 33342）結果進一步驗證，FC和FC1均隨劑量增加而減少多核破骨細胞形成，且FC1效果更優。

A. TRAP染色圖像；B.成熟破骨細胞計數；C.免疫熒光染色圖像。

圖2 FC1和FC2組分對RANKL誘導的破骨細胞分化的抑制作用

3 FC1對MAPK通路及破骨細胞生成標志物的抑制作用

MAPK通路抑制：FC1和FC2均以劑量依賴性方式抑制ERK、p38、JNK的磷酸化，但FC1抑制效力更強——100～1000 μg/mL FC1可顯著降低3 種激酶的磷酸化水平，而FC2對JNK的顯著抑制僅在1000 μg/mL時出現，且FC1對JNK磷酸化的抑制效果優于FC2。

破骨細胞生成標志物調控：RANKL顯著上調TRAF6、NFATc1、組織蛋白酶K的表達，FC1在10～1000 μg/mL范圍內可顯著降低c-Fos、TRAF6、組織蛋白酶K的表達，100～1000 μg/mL時可顯著降低NFATc1的表達；FC2雖也呈劑量依賴性抑制這些標志物，但相同劑量下抑制程度弱于FC1，表明FC1在抑制破骨細胞生成標志物方面發揮更關鍵作用。

A.相對磷酸化水平柱狀圖；B～C.免疫印跡圖。

圖3 FC1和FC2對RAW264.7細胞中RANKL誘導的MAPK通路介質表達的影響

4蛋黃組分FC1抑制RANKL誘導的破骨細胞生成標志物表達

結果顯示，RANKL刺激可顯著上調TRAF6、NFATc1及組織蛋白酶K的表達（P＜0.05），表明破骨細胞生成過程被成功誘導。對于FC1組分：在10～1000 μg/mL范圍內，與對照組相比，c-Fos、TRAF6及組織蛋白酶K的表達量均顯著降低；且在100 μg/mL和1000 μg/mL下，NFATc1的表達也顯著下調（P＜0.05）。

FC2組分同樣能以劑量依賴性方式降低這些破骨細胞生成標志物的表達，但在對應質量濃度下，各蛋白的抑制程度均低于FC1組分，表明FC1亞組分的抑制效果更優。這一結果提示，FC組分中低分子質量的成分在抑制破骨細胞生成關鍵標志物表達方面發揮著更重要的作用。

A.相對蛋白水平柱狀圖；B～C. 免疫印跡圖。

圖4 FC1和FC2對RANKL誘導的破骨細胞生成因子表達的影響

5蛋黃組分FC1誘導破骨細胞凋亡

流式細胞術分析結果顯示，早期凋亡細胞（對應散點圖中的Q3象限）和晚期凋亡細胞（對應散點圖中的Q2象限）比例均隨FC1質量濃度增加呈劑量依賴性上升（圖5）。與對照組（早期凋亡細胞比例為（6.37±1.79）%）相比，10、100、1000 μg/mL FC1處理組，早期凋亡細胞比例均顯著升高（P＜0.05）。此外，在1000 μg/mL FC1處理下，晚期凋亡細胞比例為（5.80±1.10）%，顯著高于對照組（P＜0.05）。

流式細胞術散點圖顯示，隨著FC1質量濃度升高，細胞從左下象限（活細胞，Q4象限）逐漸向Q3象限（早期凋亡）和Q2象限（晚期凋亡）轉移。

A～B.早期和晚期凋亡比率柱狀圖；C.流式細胞術點圖。

圖5 FC1對RANKL誘導的破骨細胞凋亡的影響

Discussion

1研究背景與創新性

蛋黃是蛋白質與生物活性肽的重要來源，其成分在骨骼健康領域的研究已證實：蛋黃肽可通過促進成骨細胞活性、抑制破骨細胞生成發揮抗骨質疏松潛力，例如部分去磷酸化的卵黃高磷蛋白水解物可通過MAPK（JNK/p38）或NF-κB p65通路抑制RANKL誘導的RAW264.7巨噬細胞向破骨細胞分化。但現有研究對蛋黃水溶性水解物中低分子質量成分（如＜3 kDa組分）的破骨細胞分化抑制作用及信號通路調控機制關注不足，本研究正是基于此前對蛋黃組分（FA、FB、FC）成骨潛力的探索，進一步聚焦其抗破骨細胞生成功能，填補了低分子質量蛋黃成分作用機制的研究空白。

2蛋黃組分FC及亞組分FC1的作用機制分析

骨骼穩態依賴成骨細胞骨形成與破骨細胞骨吸收的平衡，骨質疏松的核心特征是破骨細胞過度活躍導致平衡失衡。本研究采用RANKL誘導的RAW264.7細胞模型（成熟的破骨細胞分化研究模型）發現，FC組分可顯著抑制成熟破骨細胞標志物TRAP的活性，且經3 kDa超濾分離后，FC1（＜3 kDa）的抑制效果顯著強于FC2（＞3 kDa），這與“無脂水溶性蛋黃蛋白可抑制腫瘤壞死因子α誘導的破骨細胞分化”的既往研究結論一致，同時拓展證實低分子質量成分（如小分子肽）是FC發揮作用的關鍵。

從信號通路來看，RANKL誘導破骨細胞生成時會激活NF-κB與MAPK 2 條核心通路，其中MAPK通路（含ERK、p38、JNK）調控破骨細胞的分化與存活。本研究發現，FC1可劑量依賴性抑制ERK、p38、JNK的磷酸化，且對ERK磷酸化的抑制效果優于FC2——ERK激活可促進c-Fos、NFATc1等破骨細胞生成關鍵基因的表達，因此FC1對ERK的強效抑制可進一步減少下游轉錄因子及功能蛋白（如組織蛋白酶K）的表達，這也是其抗破骨細胞生成活性更強的重要原因。

此外，促進成熟破骨細胞凋亡是抑制骨吸收的關鍵策略（如雙膦酸鹽、雌激素等藥物均通過此機制起效）。本研究證實FC1可誘導成熟破骨細胞凋亡，且凋亡比例隨濃度升高而增加，這一效果與FC1對MAPK通路的抑制密切相關——MAPK通路在破骨細胞存活中起核心作用，通路活性降低會直接觸發凋亡程序，進一步補充了蛋黃成分抗骨吸收的機制維度。

3研究局限性與未來方向

本研究僅通過體外細胞模型（RAW264.7細胞）驗證了FC及FC1的活性，未能完全模擬體內復雜的生理環境（如消化吸收、組織分布等）。因此，后續需優先開展體內預實驗（如采用去卵巢OVX大鼠骨質疏松模型），評估FC組分在整體動物水平的功效；同時，需明確FC1中發揮活性的具體成分（如特定小分子肽序列），并分析其吸收、分布、代謝、排泄特征，為其轉化為功能性食品成分或膳食補充劑提供更全面的理論支持。

Conclusion

3 種水溶性蛋黃組分（FA、FB、FC）中，FC對RANKL誘導的破骨細胞生成具有最顯著的劑量依賴性抑制作用；其亞組分FC1（< 3kDa）的抑制活性顯著優于FC2（＞3 kDa），證實FC中低分子質量成分是抗破骨細胞生成的核心活性物質。FC1通過多重途徑抑制破骨細胞功能：一是下調MAPK信號通路（ERK、p38、JNK）的激活，阻斷破骨細胞分化的關鍵信號傳導；二是劑量依賴性降低破骨細胞生成關鍵標志物（TRAF6、c-Fos、NFATc1、組織蛋白酶K）的表達，抑制破骨細胞的成熟與功能實現；三是誘導成熟破骨細胞凋亡，減少功能性破骨細胞數量，進一步削弱骨吸收能力。

本研究證實水溶性蛋黃水解物（尤其是FC1）具有改善骨骼健康的潛力，可作為開發骨質疏松管理相關功能性食品成分或膳食補充劑的候選。未來需通過體內實驗驗證其在體功效，并明確FC1中活性成分的結構與代謝特征，推動其從基礎研究向實際應用轉化。

Abstract

Eggs contain various bioactive proteins that influence bone health. This study investigated the effects of three water-soluble egg yolk fractions (FA, FB, and FC) and subfractions of FC (FC1 (< 3 kDa) and FC2 (> 3 kDa)) on osteoclastogenesis. FC and its subfractions showed promising osteoclastogenesis inhibitory effects by suppressing osteoclast differentiation in receptor activator of nuclear factor-κB ligand (RANKL)-induced RAW264.7 macrophages. Furthermore, they inhibited RANKL-induced activation of mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway mediators and production of key osteoclastogenic markers in a dose-dependent manner. At 1 000 μg/mL, the FC1 and FC2 fractions resulted in (53.33 ± 9.73)% and (84.00 ± 5.11)% tartrate resistant acid phosphatase-positive osteoclasts, respectively, indicating that the FC1 fraction exhibited stronger inhibitory activity on osteoclastogenesis than the FC2 fraction. Furthermore, the FC1 fraction induced the apoptosis of mature osteoclasts, significantly increasing the proportion of cells in early apoptosis at 10, 100, and 1 000 μg/mL doses ((21.50 ± 1.93)%, (29.17 ± 2.04)%, and (40.40 ± 1.91)%, respectively) and late apoptosis at 1 000 μg/mL ((5.80 ± 1.10)%) compared to the control ((6.37 ± 1.79)% early apoptosis, (0.33 ± 0.58)% late apoptosis). While this study demonstrated the involvement of the MAPK pathway, further investigation is required to confirm their activity

in vivo

引文格式

Fernando IPS, Wu J. Water-soluble egg yolk hydrolysate shows osteoclastogenesis inhibitory effects. Food Science of Animal Products, 2025, 3(3): 9240125. https://doi.org/10.26599/FSAP.2025.9240125

編輯：張慶芬、閻一鳴； 責任編輯：劉莉