用中藥入血成分鑒定發了篇2區：清郁養精方調節下丘腦-垂體-性腺軸、抑制氧化應激與凋亡，改善少弱精子癥~

【寫在前面】：本期推薦的是由江蘇省中醫院、南京中醫藥大學第一臨床醫學院等研究團隊合作近期發表于Journal of Ethnopharmacology(IF5.4）的一篇文章，揭示清郁養精方通過調節下丘腦-垂體-性腺軸,抑制大鼠睪丸氧化應激和細胞凋亡,從而改善環磷酰胺誘導的少弱精子癥。

【期刊簡介】

【題目及作者信息】

Qingyu Yangjing formula ameliorates cyclophosphamide-induced oligoasthenospermia by regulating the hypothalamic-pituitary-gonadal axis and inhibiting testicular oxidative stress and apoptosis in rats

民族藥理學相關性

清郁養精方（QYYJF）是一種傳統中藥（TCM），是治療少弱精子癥（OAS）的經典方劑，在補腎填精方面具有顯著的臨床療效。然而，其化學成分尚不明確，且QYYJF治療OAS的作用機制仍不清楚。

研究目的

表征QYYJF吸收入血的原型化學成分，并闡明其對大鼠OAS的治療作用。

方法

為鑒定吸收入血的原型化合物，在給大鼠連續5天灌胃QYYJF（11.55 g/kg）后采集血清樣本，采用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜（UPLC-Q-TOF-MS/MS）進行分析。將40只雄性大鼠腹腔注射環磷酰胺（CP）（40 mg/kg），連續5天，建立OAS模型，隨后分別給予低、中、高劑量（5.77、11.55和17.32 g/kg/d）的QYYJF治療14天。使用Makler計數板評估精子質量。采用酶聯免疫吸附測定法（ELISA）檢測血清下丘腦-垂體-性腺（HPG）軸激素、睪丸氧化應激標志物和炎癥細胞因子。采用蘇木精-伊紅（HE）染色觀察組織病理學變化，并使用蛋白質印跡法（WB）分析凋亡相關蛋白（Bcl2、Bax、cleaved Caspase-3和cleaved Caspase-9）的表達水平。

結果

在血清中共檢測到515個原型成分，其中25個經結構鑒定，主要為黃酮類、三萜皂苷類、苯丙素類和內酯類化合物。CP誘導的OAS大鼠睪丸重量、睪丸指數、精子密度和活力顯著降低，HPG軸激素紊亂，氧化應激水平升高，炎癥細胞因子增加。HE結果顯示睪丸組織出現嚴重結構損傷，同時凋亡相關蛋白表達增加。QYYJF治療可改善這些變化，提高精子質量，恢復激素平衡，減輕氧化應激和炎癥，并抑制睪丸細胞凋亡。

結論

CP通過破壞HPG軸平衡、誘導氧化應激和細胞凋亡來損傷精子發生。QYYJF通過恢復HPG軸功能、減輕氧化應激和炎癥、抑制睪丸細胞凋亡，發揮對OAS的治療作用。

圖文摘要

【前言】

男性不育癥因不健康的生活方式和日益增加的生活壓力而成為一個全球性問題。少弱精子癥的特征是精子數量顯著減少和活力受損，是男性不育的主要原因。全球范圍內，15%的育齡夫婦存在不育問題，其中50%與男性不育有關。西醫治療該病主要采用左卡尼汀、維生素E和抗雌激素藥物，但由于療效不一和不良反應，其臨床應用常受限制。

多種化療藥物，包括環磷酰胺，被廣泛用于癌癥治療。然而，環磷酰胺是不育癥的主要原因。它通過氧化應激、炎癥、細胞凋亡和性激素失衡等機制，誘導睪丸組織損傷，破壞精子發生，并導致少弱精子癥。這凸顯了針對環磷酰胺誘導的生殖毒性尋求有效治療策略的迫切性。

傳統中醫藥憑借其在治療生殖疾病方面數千年的臨床實踐經驗，為男性不育癥提供了一種有前景的療法。在中醫理論中，男性不育根據特定的病因病機和辨證論治，使用中藥復方進行分類和治療。包含菟絲子、枸杞子及其他補腎中藥的中藥復方，傳統上用于補腎填精，這是中醫體系中治療男性不育的關鍵原則。既往研究闡明了中藥對精子質量的潛在益處。然而，這些中藥復方針對環磷酰胺誘導的生精功能損傷的具體保護作用、其入血成分的鑒定以及潛在的蛋白質通路仍有待深入探索。

精子發生受下丘腦-垂體-性腺軸調控。中藥通過影響促性腺激素釋放激素、雌二醇、黃體生成素、卵泡刺激素和睪酮的釋放來調節HPG軸激素。此外，中藥還能增強支持細胞和間質細胞的功能，減輕睪丸炎癥，對抗氧化應激，并減少細胞凋亡。同時，它們可能改善睪丸微環境，降低睪丸組織中的氧化應激，促進精子發生，提高精子質量。闡明中藥 Efficacy 的作用機制對于理解其整體治療效應和作用機理至關重要。

超高效液相色譜串聯四極桿飛行時間質譜是一種強大的分析技術，能夠實現復雜組分的快速分離和高靈敏度鑒定。該技術對于鑒定給藥后吸收入血的中藥復方生物活性成分至關重要。

清郁養精方，原名聚精湯，首載于《徐福松男科綱目》，源于徐福松教授的臨床經驗方，適用于腎虛型少弱精子癥所致的不育癥。因后期中藥新藥轉化及江蘇省藥品監督管理局審批的要求，“聚精湯”更名為清郁養精方。作為循證中藥復方，該方經過江蘇省中醫院多年的臨床經驗優化。近年來，其在少弱精子癥患者中顯示出顯著的治療效果，體現了中醫治療少弱精子癥的 holistic 理念。該方基于“腎主生殖”理論，融合“補腎”與“填精”之法，針對少弱精子癥的核心病機——腎精虧虛進行治療。該方由菟絲子、枸杞子等補腎填精的經典中藥組成，旨在填精益氣，并促進氣血沿HPG軸運行。自2010年代初以來的初步臨床觀察表明，清郁養精方及其隨證加減，能提高腎虛型少弱精子癥患者的精子質量參數和妊娠結局。然而，其潛在機制尚未完全闡明。

盡管清郁養精方的臨床經驗應用已有初步記載，但尚缺乏針對環磷酰胺誘導的少弱精子癥 Efficacy 的全面科學驗證，同時對其入血成分的鑒定以及在分子和組織學水平上的機制理解也存在不足。本研究旨在采用多維度方法：建立環磷酰胺誘導的少弱精子癥大鼠模型，通過評估精子質量和采用ELISA法檢測血清中HPG軸激素水平，以評價清郁養精方的治療效果。采用ELISA法檢測睪丸組織中關鍵氧化應激和炎癥細胞因子的水平。采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術鑒定清郁養精方給藥后吸收入血的原型成分，從而闡明其體內藥效成分。采用蘇木精-伊紅染色評估睪丸組織病理學，并通過蛋白質印跡法分析睪丸組織中關鍵的凋亡相關蛋白Bax、Bcl2、Caspase-3和Caspase-9，以闡明潛在的蛋白通路機制。通過將入血成分鑒定與功能評估、組織病理學和蛋白通路分析相結合，本研究為清郁養精方對抗環磷酰胺誘導的睪丸組織損傷提供了全面的理解。研究結果為清郁養精方的臨床應用奠定了藥理學基礎，并有助于更好地理解中醫藥治療少弱精子癥的機制。

【結果部分】

1. 清郁養精方中鑒定的成分類型。

圖 1 清郁養精方（QYYJF）血中原型成分示意圖（a）正離子模式；（b）負離子模式

2.清郁養精方的化學結構及裂解規律。

圖2. 可能的裂解途徑。（a）金絲桃苷；（b）隱丹參酮；（c）原兒茶醛。

圖 3. 可能的裂解途徑。（d）異毛蕊花糖苷；（e）毛蕊花糖苷。

3.清郁養精方顯著改善少弱精子癥大鼠的生精功能。

圖 4. 睪丸組織 HE 染色（200×，比例尺 = 200 μm）。組織病理學分析顯示，模型組精子發生嚴重紊亂，生精小管受損，生精細胞層減少。在 QYYJF 和左卡尼汀組中，這些病理改變得到顯著改善（見白色方框內）。

圖 5. QYYJF 改善少弱精子癥大鼠睪丸組織重量和精子質量（a）雙側睪丸重量；（b）睪丸指數；（c）精子密度；（d）精子活力。結果以均值 ± 標準差表示（n = 8）。

圖 6. QYYJF 改善少弱精子癥大鼠 HPG 軸血清激素水平（a）血清睪酮水平；（b）血清黃體生成素水平；（c）血清卵泡刺激素水平；（d）血清促性腺激素釋放激素水平；（e）血清雌二醇水平。

圖 7. QYYJF 改善少弱精子癥大鼠睪丸組織氧化應激水平和炎癥細胞因子（a）睪丸組織 SOD 活性；（b）睪丸組織 MDA 含量；（c）睪丸組織 GSH-PX 活性；（d）睪丸組織 ROS 熒光強度；（e）睪丸組織 TNF-α 水平；（f）睪丸組織 IL-6 水平；（g）睪丸組織 IL-1β 水平。

圖 8. 睪丸組織中凋亡相關蛋白表達水平及定量結果（a）Bax；（b）Bcl2；（c）裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3；（d）裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9；（e）蛋白表達定量結果。

【結論與討論】

環磷酰胺破壞了大鼠睪丸組織的結構和功能，導致少弱精子癥的發生。清郁養精方作為一種中藥復方，通過調節下丘腦-垂體-性腺軸相關激素，減輕睪丸組織的氧化損傷和炎癥，并抑制生精細胞凋亡，從而發揮補腎填精之效，成為治療少弱精子癥的有效方法。

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