藥學2區(qū)（4.7）-Int Immunophar-冬凌草乙素通過雙重抑制RIPK1介導的神經(jīng)炎癥和壞死性凋亡改善阿爾茨海默病

【寫在前面】：本期推薦的是由成都中醫(yī)藥大學、中國科學院昆明植物研究所等研究團隊合作近期發(fā)表于International Immunopharmacology(IF4.7）的一篇文章，揭示冬凌草乙素通過雙重抑制RIPK1介導的神經(jīng)炎癥和壞死性凋亡改善阿爾茨海默病。

【期刊簡介】

【題目及作者信息】

Ponicidin ameliorates Alzheimer's disease through dual inhibition of RIPK1-mediated neuroinflammation and necroptosis

冬凌草乙素是從冬凌草中分離得到的一種二萜類化合物，具有廣泛的藥理活性，包括抗炎作用。然而，其在阿爾茨海默病中的治療潛力，特別是在調控受體相互作用蛋白激酶1介導的神經(jīng)炎癥和壞死性凋亡方面的作用，尚未得到充分探索。本研究旨在探討冬凌草乙素靶向RIPK1以緩解AD發(fā)病機制的途徑。通過生物膜層干涉技術和藥物親和反應靶點穩(wěn)定性實驗，證實了冬凌草乙素與RIPK1之間的相互作用。在體外，使用酶聯(lián)免疫吸附測定、逆轉錄實時定量聚合酶鏈式反應、蛋白質印跡法和流式細胞術，評估了冬凌草乙素對BV2小膠質細胞和HT22海馬神經(jīng)元細胞的炎癥反應及壞死性凋亡的影響。在體內，通過對5×FAD轉基因AD模型小鼠進行行為學測試、組織學分析和生化檢測，評估了冬凌草乙素的治療效果。研究發(fā)現(xiàn)，冬凌草乙素能以高親和力與RIPK1結合，并增強RIPK1對蛋白水解降解的抵抗能力。在小膠質細胞中，冬凌草乙素通過破壞RIPK1-JAK1-STAT1信號通路，有效抑制了促炎細胞因子IL-6和TNF-α的釋放。在神經(jīng)元中，冬凌草乙素通過阻斷RIPK1-RIPK3-MLKL級聯(lián)反應，抑制了RIPK1介導的壞死性凋亡。對5×FAD小鼠的行為學分析表明，冬凌草乙素治療能顯著改善認知功能，減少腦內β-淀粉樣蛋白斑塊沉積，并減輕神經(jīng)炎癥和壞死性凋亡。冬凌草乙素通過靶向RIPK1，對AD中兩個關鍵的病理過程——神經(jīng)炎癥和壞死性凋亡——產(chǎn)生雙重神經(jīng)保護作用。這些發(fā)現(xiàn)凸顯了冬凌草乙素作為AD疾病修飾療法的潛力，并為天然產(chǎn)物來源的RIPK1抑制劑在神經(jīng)退行性疾病中的臨床開發(fā)提供了基礎。

【前言】

阿爾茨海默病（AD）是一種進行性、致殘性的神經(jīng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為記憶喪失、認知功能障礙和行為異常。AD的標志性病理特征包括β-淀粉樣蛋白（Aβ）斑塊沉積和由Tau蛋白過度磷酸化導致的神經(jīng)原纖維纏結形成。然而，越來越多的證據(jù)表明，這些經(jīng)典病理的發(fā)生和發(fā)展并非僅由蛋白質聚集引起，而與神經(jīng)炎癥的慢性激活和神經(jīng)元死亡密切相關。目前AD的標準治療主要包括膽堿酯酶抑制劑（如多奈哌齊、卡巴拉汀、加蘭他敏）和N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑（如美金剛）。雖然這些療法能夠緩解癥狀，但無法阻止或逆轉疾病進展。近年來，抗Aβ單克隆抗體（如侖卡奈單抗和多奈單抗）作為疾病修飾療法顯示出一定潛力。然而，其臨床應用受限于高昂的成本、復雜的給藥方案以及腦水腫和出血等安全性問題，且其神經(jīng)保護作用相對有限。因此，迫切需要探索新的病理機制和分子靶點，以開發(fā)更安全、更有效的AD治療策略。

慢性神經(jīng)炎癥在AD發(fā)病機制中起關鍵作用。活化的小膠質細胞和星形膠質細胞釋放一系列促炎細胞因子，包括白細胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-6（IL-6）。這些細胞因子通過JAK1/STAT1通路傳遞炎癥信號，誘導下游基因轉錄并放大炎癥反應。在AD患者和動物模型中，JAK1/STAT1通路常被過度激活，特別是STAT1磷酸化水平升高，從而維持膠質細胞的促炎表型，加劇神經(jīng)炎癥。抑制JAK1/STAT1信號已被證明可以減輕膠質細胞過度活化，促進Aβ清除，并改善突觸功能和認知缺陷。重要的是，受體相互作用蛋白激酶1（RIPK1）已成為這一炎癥級聯(lián)反應中的關鍵上游分子，作為細胞死亡和炎癥信號交匯點的核心調控因子。在AD小膠質細胞中，異常的RIPK1激活促進了促炎細胞因子的釋放，并通過JAK1/STAT1信號放大炎癥，形成神經(jīng)炎癥的惡性循環(huán)。

除了炎癥，壞死性凋亡——一種受調控的程序性細胞死亡形式——已被認為是導致AD神經(jīng)元丟失的主要機制。該過程由死亡受體信號（如TNF-α/TNFR1）觸發(fā)，并依賴于RIPK1激酶活性：當?shù)蛲霰蛔钄鄷r，RIPK1與RIPK3相互作用并募集MLKL，形成壞死小體復合物，最終導致細胞膜破裂和細胞內容物釋放。與凋亡不同，壞死性凋亡會釋放大量損傷相關分子模式（DAMPs），進一步加劇炎癥。研究表明，在AD患者大腦中，RIPK1、RIPK3和MLKL的磷酸化水平顯著升高，且與磷酸化Tau蛋白的積累以及Braak分期進展相關。此外，RIPK1水平與腦重量和認知功能呈負相關，表明其異常激活加速了神經(jīng)元丟失。在臨床前模型中，Aβ寡聚體負荷的增加與pMLKL表達升高有關，并且通過基因或藥理學方法抑制壞死性凋亡均能有效緩解Aβ誘導的神經(jīng)元變性和認知障礙。此外，由Aβ激活的小膠質細胞釋放的TNF-α可通過TNF/RIPK1軸誘導神經(jīng)元壞死性凋亡，阻斷該通路能有效防止神經(jīng)元損傷。這些發(fā)現(xiàn)突顯了AD中炎癥與壞死性凋亡的相互促進關系，而RIPK1則充當了二者的關鍵樞紐。動物模型研究進一步支持了抑制RIPK1激酶活性可顯著減輕炎癥、保護神經(jīng)元并改善AD樣病理和認知功能的觀點。目前已有數(shù)種小分子RIPK1抑制劑進入臨床開發(fā)階段，其中包括可滲透腦屏障的抑制劑SAR443060（DNL747），該藥已進入針對AD患者的II期臨床試驗。這些進展凸顯了RIPK1作為AD治療的一個有前景的靶點。

傳統(tǒng)草藥為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了豐富但尚未被充分利用的生物活性化合物資源。在東亞草藥中，冬凌草（Rabdosia rubescens）素有治療炎癥性疾病的歷史。該植物的藥理作用歸因于多種植物化學物質，包括二萜、三萜、生物堿、黃酮類和多糖。冬凌草乙素（Pon）是從冬凌草中分離得到的一種對映-貝殼杉烷型二萜化合物，具有廣泛的藥理活性，包括抗炎、神經(jīng)保護和抗腫瘤作用。在糖尿病并發(fā)癥模型中，Pon下調IL-1β、TNF-α和IL-6等促炎細胞因子，同時上調IL-4和IL-10，從而改善炎癥狀態(tài)。在神經(jīng)元中，Pon減輕了Aβ1-42誘導的損傷，并通過激活SIRT1-PI3K/Akt通路發(fā)揮保護作用。此外，Pon在各種疾病模型中顯示出抗氧化和抗凋亡活性，并能誘導腫瘤細胞周期停滯和程序性細胞死亡，突顯了其多靶點藥理潛力。盡管其藥理特性前景廣闊，但Pon在AD模型中的體內效應及其對壞死性凋亡的影響此前尚未明確。本研究表明，Pon直接靶向RIPK1，減弱小膠質細胞中RIPK1-JAK1-STAT1炎癥通路，并阻斷神經(jīng)元中RIPK1-RIPK3-MLKL介導的壞死性凋亡，從而顯著改善5×FAD小鼠模型的認知缺陷。這些發(fā)現(xiàn)不僅揭示了Pon先前未被認識的機制，并通過確定RIPK1為其直接靶點填補了天然產(chǎn)物藥理學中的一個關鍵空白，而且為理解AD的潛在病理過程提供了新見解。

【結果部分】

1. 冬凌草乙素的直接分子靶點：RIPK1。

圖1 冬凌草乙素抑制促炎細胞因子產(chǎn)生并靶向RIPK1。(A) 冬凌草乙素的化學結構，這是一種從冬凌草中分離得到的天然二萜化合物。(B–C) RT-qPCR分析顯示冬凌草乙素在BV2細胞中抑制促炎細胞因子的轉錄。細胞先用冬凌草乙素（5 μM）或Nec-1（10 μM）預處理30分鐘，再用LZ刺激4小時。Tnf-α和Il-6的相對mRNA表達水平經(jīng)Gapdh歸一化后進行定量。(D–E) ELISA結果顯示冬凌草乙素減少LZ誘導的細胞因子分泌。BV2細胞先用冬凌草乙素（5 μM）或Nec-1（10 μM）預處理30分鐘，再用LZ刺激8小時。測定上清液中IL-6和TNF-α的水平。(F) BV2細胞以每孔1.2 × 10?個細胞接種于96孔板，培養(yǎng)18小時。進行冬凌草乙素處理時，從100 μM開始進行系列稀釋，直至1.56 μM（共8個濃度）。處理8小時后，使用CCK-8法評估細胞活力。測得冬凌草乙素的CC50為59.360 ± 3.58 μM。(G) BLI分析顯示冬凌草乙素與RIPK1的結合相互作用，解離常數(shù)KD為135 nM。(H) DARTS實驗證明冬凌草乙素增強了HT22細胞中RIPK1對蛋白水解降解的抵抗能力。細胞接種于10 cm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)18小時后進行DARTS實驗。

2.冬凌草乙素經(jīng)由RIPK1–JAK1–STAT1軸緩解小膠質細胞神經(jīng)炎癥。

圖2 冬凌草乙素通過抑制RIPK1–JAK1–STAT1信號軸減輕神經(jīng)炎癥。 (A-B) BV2細胞用遞增濃度的冬凌草乙素處理，隨后用LZ刺激8小時。通過ELISA測定IL-6和TNF-α水平，計算抑制率并確定半抑制濃度。(C–K) 冬凌草乙素（5 μM）與Nec-1（10 μM）抑制BV2細胞中LZ誘導的RIPK1、JAK1和STAT1磷酸化。細胞經(jīng)冬凌草乙素或Nec-1處理30分鐘后，用LZ刺激4小時。通過蛋白質印跡分析蛋白水平，以Actin作為內參蛋白。

3.冬凌草乙素通過抑制RIPK1–RIPK3–MLKL級聯(lián)反應阻斷神經(jīng)元壞死性凋亡。

圖3 冬凌草乙素通過阻斷RIPK1–RIPK3–MLKL信號通路抑制神經(jīng)元壞死性凋亡。(A) BV2細胞以每孔1.2 × 10?個細胞接種于96孔板，培養(yǎng)18小時。使用冬凌草乙素處理時，從100 μM開始進行倍比系列稀釋至1.56 μM（共8個濃度）。處理8小時后，采用CCK-8法檢測細胞活力，測得其CC50為29.50 ± 0.204 μM。(B) 在經(jīng)冬凌草乙素（5 μM）預處理30分鐘、隨后用TZ刺激的HT22神經(jīng)元中進行LDH釋放的時序測定。(C) 對Hoechst（藍色，細胞核染色）和PI（紅色，死細胞標記物）染色的HT22細胞進行高內涵成像分析。HT22神經(jīng)元經(jīng)冬凌草乙素（5 μM）或Nec-1（10 μM）預處理30分鐘后，用TZ刺激8小時。“Merge”圖像為Hoechst與PI染色的疊加。(D) 各組細胞死亡百分比的定量分析。(E) 流式細胞術分析經(jīng)冬凌草乙素或Nec-1預處理30分鐘、隨后用TZ刺激8小時的HT22神經(jīng)元的壞死性凋亡情況。壞死細胞在Q2象限進行定量。(F) 流式細胞術Q2象限的定量分析。(G-M) 冬凌草乙素和Nec-1抑制RIPK1、RIPK3和MLKL的磷酸化。細胞經(jīng)冬凌草乙素或Nec-1處理30分鐘后，用TZ刺激4小時。

4.冬凌草乙素通過抑制RIPK1緩解炎癥微環(huán)境誘導的神經(jīng)元壞死性凋亡。

圖4 冬凌草乙素抑制小膠質細胞誘導的HT22神經(jīng)元壞死性凋亡。(A) 采用高內涵成像分析HT22細胞經(jīng)BV2細胞上清液刺激8小時后的情況（實驗方法詳見第2.4節(jié)）。HT22細胞經(jīng)Hoechst（藍色，細胞核染色）與PI（紅色，死細胞標記物）染色，“Merge”圖像顯示Hoechst與PI染色的疊加。(B) 各組細胞死亡百分比的定量分析。(C) LDH檢測表明，冬凌草乙素與Nec-1均能顯著降低BV2-LZ-su誘導的神經(jīng)元細胞毒性。(D) 將TNF-α抗體與HT22神經(jīng)元預孵育后，再用BV2-LZ-su處理。活細胞比例分析顯示，TNF-α是HT22細胞中壞死性凋亡的主要介導因子。(E-K) 蛋白質印跡分析表明，冬凌草乙素或Nec-1處理能減弱BV2-LZ-su刺激的HT22細胞中RIPK1、RIPK3和MLKL的磷酸化。

5.冬凌草乙素通過抑制神經(jīng)炎癥與壞死性凋亡改善5×FAD小鼠的認知缺陷。

圖5 冬凌草乙素改善5×FAD轉基因小鼠的認知功能。 (A) T迷宮實驗示意圖。(B–D) T迷宮實驗結果顯示，與未處理的5×FAD小鼠相比，經(jīng)冬凌草乙素（10 mg/kg）或Nec-1（10 mg/kg）處理的5×FAD小鼠在探索新臂時行進距離更長、進入新臂次數(shù)更多、探索新臂的潛伏期更短。(E) Y迷宮實驗示意圖。(F–H) Y迷宮實驗數(shù)據(jù)表明，與未處理的5×FAD小鼠相比，冬凌草乙素（10 mg/kg）和Nec-1（10 mg/kg）處理使5×FAD小鼠探索新臂的行進距離更長、進入新臂次數(shù)更多、探索新臂的潛伏期更短。

圖6 冬凌草乙素改善5×FAD轉基因小鼠的空間學習與記憶能力。(A) 巴恩斯迷宮實驗示意圖。(B–D) 巴恩斯迷宮結果顯示，與未處理的5×FAD小鼠相比，經(jīng)冬凌草乙素（10 mg/kg）或Nec-1（10 mg/kg）處理的5×FAD小鼠表現(xiàn)出更短的目標區(qū)潛伏期、更少的目標區(qū)錯誤次數(shù)以及更低的目標區(qū)偏離度。(E) 探索試驗期間的代表性游泳軌跡。(F) 第5天的莫里斯水迷宮探索試驗顯示，與未處理的5×FAD小鼠相比，經(jīng)冬凌草乙素（10 mg/kg）或Nec-1（10 mg/kg）處理的5×FAD小鼠在平臺區(qū)域停留時間更長。

圖7 冬凌草乙素治療減少5×FAD小鼠的Aβ斑塊沉積并減輕神經(jīng)炎癥與壞死性凋亡。(A–L) 腦組織蛋白質印跡分析顯示，冬凌草乙素治療降低了APP的表達，減少了JAK1-STAT1通路標記物（pJAK1與pSTAT1）以及促炎細胞因子TNF-α和IL-6的水平。同時，冬凌草乙素通過降低RIPK1、RIPK3和MLKL的磷酸化緩解了壞死性凋亡。以Actin作為內參蛋白。(M) 免疫組織化學分析表明，冬凌草乙素（10 mg/kg）和Nec-1（10 mg/kg）有效減少了5×FAD小鼠海馬和皮層中的Aβ斑塊沉積。

6. 冬凌草乙素雙重保護機制示意圖。

圖8 冬凌草乙素雙重保護機制示意圖。在阿爾茨海默病小鼠模型中，冬凌草乙素通過抑制RIPK1–JAK1–STAT1信號軸，減少小膠質細胞分泌TNF-α等神經(jīng)炎癥因子，從而緩解神經(jīng)炎癥；同時，冬凌草乙素阻斷RIPK1–RIPK3–MLKL信號級聯(lián)反應，抑制神經(jīng)元壞死性凋亡。

【結論與討論】

冬凌草乙素通過靶向RIPK1，對AD中兩個關鍵的病理過程—神經(jīng)炎癥和壞死性凋亡—產(chǎn)生雙重神經(jīng)保護作用。這些發(fā)現(xiàn)凸顯了冬凌草乙素作為AD疾病修飾療法的潛力，并為天然產(chǎn)物來源的RIPK1抑制劑在神經(jīng)退行性疾病中的臨床開發(fā)提供了基礎。

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