關(guān)于寡核苷酸類藥物開展組織分布研究的些許工業(yè)界經(jīng)驗(yàn)

寡核苷酸治療藥物（Oligonucleotide therapeutics, ONTs）已成為一類具有變革意義的新型藥物，主要包括siRNA、ASO、mRNA、適配體以及單鏈和雙鏈DNA寡核苷酸等。過去十年中，得益于其良好的安全性以及能夠靶向以往“不可成藥”的通路，這類藥物在制藥研發(fā)管線中的地位日益突出。

寡核苷酸具有模塊化設(shè)計(jì)特點(diǎn)，使其在早期研發(fā)階段能夠快速迭代優(yōu)化，尤其適用于探索全新作用機(jī)制的項(xiàng)目。同時(shí)，化學(xué)修飾技術(shù)與靶向遞送系統(tǒng)的顯著進(jìn)步——如N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）偶聯(lián)物和脂質(zhì)納米顆粒（LNP）等——大幅提升了組織特異性和治療指數(shù)，從而提高了臨床成功率。

與傳統(tǒng)小分子藥物不同，ONTs展現(xiàn)出獨(dú)特的藥代動(dòng)力學(xué)特征：系統(tǒng)清除迅速，但在靶組織中滯留時(shí)間較長(zhǎng)，導(dǎo)致其PK-PD關(guān)系更為復(fù)雜。這種特性使得暴露-效應(yīng)評(píng)估變得困難，因?yàn)檠獫{中的系統(tǒng)濃度往往無法準(zhǔn)確反映靶組織的實(shí)際藥物暴露水平。因此，對(duì)治療活性和安全性的評(píng)估越來越依賴于組織特異性藥物濃度，凸顯了建立可靠生物分析策略以表征藥物體內(nèi)分布的重要性。

盡管業(yè)界已普遍認(rèn)識(shí)到組織藥物濃度測(cè)定的重要性，但各公司在具體實(shí)施方法上仍存在較大差異。美國FDA近期發(fā)布的《寡核苷酸治療藥物臨床藥理學(xué)考量》草案指南明確強(qiáng)調(diào)，需開展全面的體內(nèi)分布研究，并采用穩(wěn)健的生物分析方法來定量寡核苷酸母藥及其相關(guān)代謝物。這一監(jiān)管導(dǎo)向進(jìn)一步凸顯了行業(yè)亟需就組織水平評(píng)估的最佳實(shí)踐達(dá)成共識(shí)。

本文分享下IQ Consortium調(diào)研的11家制藥企業(yè)在ONT體內(nèi)分布評(píng)估方面的實(shí)際操作情況。

體內(nèi)分布評(píng)估的頻率

在10家明確開展ONT研發(fā)的公司中：50%始終在發(fā)現(xiàn)和開發(fā)階段評(píng)估體內(nèi)分布；40%根據(jù)具體項(xiàng)目需求或以探索性方式開展；10%則根據(jù)化合物特性靈活決定，而非例行進(jìn)行。

此外，70%的公司在候選藥物確認(rèn)過程中常規(guī)測(cè)定組織藥物濃度，30%則間歇性開展。

企業(yè)開展常規(guī)體內(nèi)分布評(píng)估的主要?jiǎng)右?/b>

確認(rèn)藥物在作用部位的暴露；支持PK/PD建模；評(píng)估藥物在靶器官和清除器官中的分布；為基于PBPK和TK模型提供數(shù)據(jù)支持。

組織藥物濃度測(cè)定策略與時(shí)間節(jié)點(diǎn)

30%的公司將組織濃度分析視為選擇性手段，而非常規(guī)操作。這類評(píng)估通常依據(jù)以下關(guān)鍵因素觸發(fā)：需確認(rèn)藥物在藥理相關(guān)組織中的分布；監(jiān)測(cè)已知或潛在毒性部位的暴露；應(yīng)對(duì)體內(nèi)研究中出現(xiàn)的意外結(jié)果。

在這些情況下，組織水平的PK數(shù)據(jù)成為連接給藥劑量、分布特征與藥效/安全性結(jié)果的關(guān)鍵機(jī)制橋梁。

評(píng)估時(shí)間點(diǎn)分布如下：1）先導(dǎo)化合物（lead compoud）優(yōu)化前：50%的公司進(jìn)行組織濃度測(cè)定，主要用于早期藥理篩選；2）先導(dǎo)優(yōu)化至候選藥物(PCC)選定階段：比例升至90%，反映此階段對(duì)理想組織分布特性的高度依賴；3）候選藥物確定至首次人體試驗(yàn)（FIH）前：80%的公司持續(xù)開展組織測(cè)定；4）FIH之后：比例回落至50%，表明此時(shí)更多依賴前期建立的PK模型和安全性數(shù)據(jù)。

臨床前動(dòng)物種屬與組織采樣情況

在臨床前研究中，小鼠（包括C57BL/6、CD-1和BALB/c品系）是最常用的動(dòng)物模型，主要因其疾病模型豐富且所需化合物量少（通常僅需1-3mg）。

大鼠（如Sprague–Dawley和Wistar）則常用于劑量探索研究，作為中間模型。

食蟹猴是主要的非嚙齒類動(dòng)物模型，被70%的公司采用，原因在于其與人類具有超過85%的靶序列同源性，且核酸酶表達(dá)模式相似。

在組織采樣方面：血清或全血是最常采集的基質(zhì)（90%的公司）；肝臟次之（80%），因其是寡核苷酸藥物的主要蓄積和代謝器官；腎臟也被廣泛采樣（60%），作為關(guān)鍵清除途徑之一；肌肉和脾臟則僅在特定靶點(diǎn)相關(guān)項(xiàng)目中被部分公司采集。

生物分析中的歸一化、一致性與檢測(cè)技術(shù)

為減少實(shí)驗(yàn)變異并確?？缪芯繑?shù)據(jù)的一致性，各公司采用多種歸一化策略：50%的公司使用獨(dú)立生物標(biāo)志物或其他內(nèi)源性分析物進(jìn)行歸一化；30%采用總蛋白定量；60%使用其他方法，如加入內(nèi)標(biāo)或按組織重量歸一化。

這些策略對(duì)寡核苷酸項(xiàng)目尤為重要，因?yàn)槠浣^對(duì)定量易受基質(zhì)效應(yīng)、穩(wěn)定性差異及細(xì)胞攝取不均等因素干擾。

常用組織濃度檢測(cè)技術(shù)包括：1）qPCR/RT-qPCR/ddPCR（80%）；2）雜交法（hybridization assays，70%）；3）液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC/MS，100%）——因其能特異性識(shí)別母體藥物并表征代謝物，已成為行業(yè)標(biāo)配；4）配體結(jié)合分析（LBA，50%）；5）免疫熒光成像（20%）；6）放射性標(biāo)記計(jì)數(shù)（10%）。

在組織與血漿基質(zhì)間的方法一致性方面：僅有20%的公司始終使用相同分析方法；其余80%根據(jù)基質(zhì)特性或具體分析需求，采用基質(zhì)適配（matrix-dependent）或“適用即用”（fit-for-purpose）策略。

盡管方法各異，所有公司均以組織重量對(duì)濃度數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化。此外，30%的公司還輔以總RNA/DNA含量、看家基因表達(dá)水平或外源內(nèi)標(biāo)進(jìn)一步校正。

組織樣本中殘留血液污染的處理

血液殘留可能干擾組織藥物濃度的真實(shí)評(píng)估，但各公司對(duì)此處理方式不一：僅20%的公司始終考慮血液污染問題；40%偶爾考慮；40%完全未處理。

為減少血液干擾，部分公司采用器官灌注：10%常規(guī)進(jìn)行；70%偶爾進(jìn)行；20%從不進(jìn)行。

對(duì)于不進(jìn)行灌注的公司，其主要理由是：在組織采集時(shí)，系統(tǒng)循環(huán)中的藥物濃度已極低，不太可能顯著影響組織水平的解釋。

提取方法驗(yàn)證與多方法聯(lián)用策略

在組織樣本的提取效率與回收率驗(yàn)證方面，各公司做法差異顯著：77.8%的公司偶爾進(jìn)行驗(yàn)證；僅11.1%將其作為標(biāo)準(zhǔn)流程；另有11.1%完全不進(jìn)行此類驗(yàn)證。

在開展驗(yàn)證的公司中，通常遵循標(biāo)準(zhǔn)的生物分析開發(fā)流程，包括：方法優(yōu)化、回收率測(cè)試以及跨基質(zhì)的重現(xiàn)性研究。

關(guān)于是否采用多種檢測(cè)方法：80%的公司表示有時(shí)會(huì)結(jié)合多種分析技術(shù)；20%則僅依賴單一平臺(tái)。

在生物分析方法的資格認(rèn)證（qualification）方面：90%的公司采用“適用即用”（fit-for-purpose）策略，根據(jù)具體應(yīng)用場(chǎng)景定制方法；其中，50%遵循ICH M10指導(dǎo)原則或其他相關(guān)監(jiān)管標(biāo)準(zhǔn)；40%使用未經(jīng)正式認(rèn)證的探索性方法；10%將組織勻漿和提取步驟的驗(yàn)證納入整體方法資格認(rèn)證體系。

PK/PD建模應(yīng)用及其對(duì)臨床轉(zhuǎn)化的影響

所有受訪公司均表示，寡核苷酸組織濃度數(shù)據(jù)在一定程度上用于支持人體劑量預(yù)測(cè)：100%用于指導(dǎo)轉(zhuǎn)化PK建模；80%用于構(gòu)建臨床前PK/PD模型；40%用于輔助解釋毒理或安全性發(fā)現(xiàn)。

在建模輸入?yún)?shù)選擇上：80%傾向使用總組織濃度；20%更偏好細(xì)胞內(nèi)結(jié)合態(tài)濃度（cell-associated concentrations）；此外，30%還采用其他替代指標(biāo)，如RISC復(fù)合物加載量或細(xì)胞內(nèi)蛋白復(fù)合物定量。

關(guān)于組織濃度數(shù)據(jù)對(duì)預(yù)測(cè)模型的價(jià)值：90%認(rèn)為其顯著提升了PK/PD模型在臨床轉(zhuǎn)化中的準(zhǔn)確性與相關(guān)性；僅10%認(rèn)為獲益有限，主要受限于數(shù)據(jù)質(zhì)量、生物學(xué)變異性或模型擬合困難。

在基于PBPK或mPBPK模型開發(fā)中：80%的公司偶爾使用組織濃度數(shù)據(jù)；10%常規(guī)使用；10%完全不用。

在模型的實(shí)際應(yīng)用方面：40%間歇性使用PBPK/mPBPK框架；20%常規(guī)應(yīng)用；40%在其ONT項(xiàng)目中未采用PBPK建模。

在安全性評(píng)估與關(guān)鍵決策中的應(yīng)用

在將組織濃度數(shù)據(jù)用于安全性評(píng)估方面，業(yè)界意見基本持平：50%的公司將這些數(shù)據(jù)納入安全評(píng)價(jià)；另外50%則未使用。

在使用該數(shù)據(jù)的公司中：40%表示組織濃度有助于解釋毒性機(jī)制，并指導(dǎo)后續(xù)開發(fā)決策。

而在未用于安全性評(píng)估的公司中：40%認(rèn)為這些數(shù)據(jù)非必需或不可獲得；20%對(duì)其潛在價(jià)值持不確定態(tài)度。

綜上，盡管組織濃度數(shù)據(jù)在PK/PD建模和臨床轉(zhuǎn)化中已獲廣泛認(rèn)可，但在安全性評(píng)估中的整合仍存在較大分歧，反映出當(dāng)前行業(yè)在數(shù)據(jù)應(yīng)用深度和標(biāo)準(zhǔn)化方面的挑戰(zhàn)。

本次調(diào)研結(jié)果表明，行業(yè)在ONTs組織分布評(píng)估方面的差異并非源于分析平臺(tái)本身——所有受訪公司（100%）均使用LC–MS，而主要體現(xiàn)在實(shí)施策略的不一致上。例如：僅50%的公司始終評(píng)估體內(nèi)分布，40%則根據(jù)項(xiàng)目需求靈活決定；提取方法驗(yàn)證方面，78%僅偶爾開展，僅11%將其作為常規(guī)流程；高達(dá)40%的公司完全未處理組織樣本中的血液殘留污染問題。

這些差異反映出當(dāng)前ONT研發(fā)仍以早期階段項(xiàng)目為主，盡管業(yè)界興趣濃厚，但技術(shù)挑戰(zhàn)仍在制約臨床推進(jìn)。因此，亟需在組織采集與處理流程上建立統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，以實(shí)現(xiàn)更高效的管線整合。

體內(nèi)分布評(píng)估頻率存在差異。評(píng)估頻率的不一致，既反映了各公司在資源投入上的權(quán)衡，也凸顯了缺乏行業(yè)統(tǒng)一實(shí)踐標(biāo)準(zhǔn)的問題。那些堅(jiān)持系統(tǒng)性評(píng)估的公司，通常更清楚寡核苷酸藥物血漿PK與組織PK嚴(yán)重脫節(jié)這一核心特征。

評(píng)估頻率隨研發(fā)階段動(dòng)態(tài)變化：在先導(dǎo)化合物優(yōu)化階段達(dá)90%（用于篩選理想分布特性）；FIH后降至50%，轉(zhuǎn)而依賴已建立的PK模型。這體現(xiàn)了從“探索性表征”向“模型驅(qū)動(dòng)決策”的自然演進(jìn)。

生物分析方法選擇與驗(yàn)證方面，標(biāo)準(zhǔn)化空間巨大。LC–MS被全行業(yè)采用，因其能特異性識(shí)別母藥并解析復(fù)雜的體內(nèi)代謝產(chǎn)物。qPCR/RT-qPCR和雜交法作為補(bǔ)充，提供對(duì)痕量寡核苷酸的高靈敏度檢測(cè)。

驗(yàn)證實(shí)踐差異顯著，“適用即用”策略雖具靈活性，但可能損害跨研究數(shù)據(jù)的可比性。同時(shí)，對(duì)血液污染處理不一致（僅10%常規(guī)灌注器官）以及驗(yàn)證流程缺失，均表明亟需建立標(biāo)準(zhǔn)化的生物分析工作流。

PK建模與臨床轉(zhuǎn)化方面，潛力未充分釋放。所有公司均利用組織濃度數(shù)據(jù)支持人體劑量預(yù)測(cè)，承認(rèn)僅依賴血漿數(shù)據(jù)外推存在局限。然而，PBPK/mPBPK建模應(yīng)用率偏低，僅20%常規(guī)使用，40%完全未采用。這是一種未被充分利用的機(jī)制性工具，尤其適用于非肝靶向或新型遞送系統(tǒng)的ONT。

多數(shù)公司偏好使用總組織濃度而非細(xì)胞內(nèi)結(jié)合態(tài)濃度，雖出于操作便利，但可能無法反映藥理活性部分。RISC加載量等機(jī)制性指標(biāo)使用有限（僅30%），限制了對(duì)藥效機(jī)制的深入理解。

建議，即使資源有限，也可采用簡(jiǎn)化PBPK（mPBPK），聚焦靶器官與清除器官，利用已發(fā)表的內(nèi)吞/溶酶體轉(zhuǎn)運(yùn)參數(shù)，無需依賴組織活檢，可借助藥效學(xué)生物標(biāo)志物或循環(huán)細(xì)胞外囊泡作為組織暴露的替代指標(biāo)。對(duì)監(jiān)管申報(bào)而言，PBPK模型能強(qiáng)化藥理學(xué)依據(jù)，尤其當(dāng)敏感性分析揭示種屬間受體表達(dá)或核酸酶活性差異時(shí)，可有力支持劑量選擇。

需要特別提示的是，siRNA在血漿中半衰期極短（<1小時(shí)），但組織濃度可持續(xù)數(shù)周，因此在多數(shù)情況下，血液殘留對(duì)組織濃度測(cè)定影響可忽略，相關(guān)污染評(píng)估應(yīng)依化合物特性而定。

另外，在是否將組織濃度數(shù)據(jù)用于安全性評(píng)價(jià)上，行業(yè)呈現(xiàn)五五開。使用方（50%）認(rèn)為其有助于解釋毒性機(jī)制、計(jì)算安全窗。未使用者中，40%稱“不需要或不可得”，20%則“不確定價(jià)值”。鑒于寡核苷酸的毒性常出現(xiàn)在高蓄積組織（如肝、腎），組織數(shù)據(jù)對(duì)機(jī)制性安全評(píng)估至關(guān)重要。

值得注意的是，F(xiàn)DA于2024年6月發(fā)布的指南（Clinical Pharmacology Considerations for the Development of Oligonucleotide Therapeutics Guidance for Industry）明確強(qiáng)調(diào)需開展全面的體內(nèi)分布研究，表明監(jiān)管機(jī)構(gòu)已將基于組織的評(píng)估視為必要要求。

引自：Industry Practices in Oligonucleotide Tissue Biodistribution Assessment: An IQ consortium Cross?Industry Survey of Current Approaches and Emerging Trends

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