FSHW | 海參腸四肽通過恢復線粒體動力學改善酒精性胃損傷

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Abstract

本文旨在探討四肽Val-Thr-Pro-Tyr（VTPY）在改善酒精性胃損傷方面的機制。VTPY具有增強正常人胃上皮細胞（GES-1）生長和運動的潛力。乙醇損傷后，VTPY有效改善GES-1和人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）的遷移，增強血管生成，消除細胞和線粒體活性氧（ROS），抑制過度線粒體分裂，增強F-肌動蛋白聚合和線粒體內呼吸能力。為了抵消線粒體過度裂解，VTPY主要通過減少Drp 1和Fis 1的表達，同時增加Mfn2來恢復線粒體動力學。利用抑制劑的進一步研究表明，抑制過度的線粒體裂變可以顯著減少F-肌動蛋白的去聚合，從而增強細胞遷移。此外，VTPY可以通過維持線粒體膜電位、阻止線粒體細胞色素C的釋放、增強Bcl-XL水平，同時降低Bax和cleaved-Caspase-3的水平來抑制凋亡途徑。使用抑制劑進行的進一步研究表明，線粒體過度裂解可以激活凋亡途徑。然而，VTPY抵消了這一效應，并增強了細胞的活力。進一步的證據表明，VTPY通過Fis-1/Bcl-2通路有效改善小鼠潰瘍指數和病理變化，緩解炎癥，增強氧化和抗氧化平衡，促進血管生成，改善線粒體動力學因子的表達，阻斷凋亡途徑，進而改善小鼠胃損傷。

Introduction

酒精引起的胃黏膜損傷是全球公共衛生領域的一個重要問題，它不僅嚴重損害個體的消化系統，還給公共衛生支出帶來沉重負擔。然而，對酒精引起的胃黏膜損傷背后確切機制的全面理解尚未完全闡明。活性氧物種（ROS）在乙醇性胃病發病機制中起著重要作用，這些疾病涉及細胞信號傳導、線粒體功能以及其他與氧化應激相關的復雜生理過程。線粒體功能的損害與酒精攝入對胃黏膜細胞造成的傷害密切相關。乙醇可能破壞體內氧化與抗氧化系統之間的平衡，并激活由線粒體介導的凋亡途徑，從而對健康產生不利影響。此外，通過共同調節線粒體分裂、融合和生物合成的內穩態，保持線粒體的形態和功能對于機體健康至關重要。因此，通過調節線粒體的質量控制來緩解酒精引起的胃黏膜損傷是一種新的策略。

膳食干預并不被視為傳統藥物治療方案的替代選擇，但它們可以作為疾病管理的一種有效輔助策略。大多數由2～10個氨基酸組成、低水平的食源性生物活性肽因其良好的細胞擴散和滲透特性以及低毒性而引起了廣泛關注。然而，關于通過改善線粒體動態學來修復酒精引起的胃部損傷的肽類物質的研究有限。

海參是一種富含營養的海洋生物，長期以來一直被用作滋補食品和藥物。海參腸和巖藻多糖對吲哚美辛和乙醇引起的鼠胃黏膜損傷具有保護作用，但海參腸肽對胃黏膜損傷的有益影響仍有待研究。通過海參腸的自溶過程制備并鑒定出一種海參腸肽，Val-Thr-Pro-Tyr（VTPY）。已有研究表明，這種肽能夠清除自由基，并保護細胞免受H2O2引起的DNA損傷。最近進行的一項研究發現，VTPY能夠促進人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）和人類皮膚成纖維細胞的生長和運動，改善線粒體呼吸，并加速傷口愈合。然而，尚無證據表明VTPY能夠改善胃部損傷。因此，本研究旨在評估VTPY減輕乙醇引起的胃部損傷的潛在效果。

Results and Discussion

VTPY促進GES-1細胞的存活能力

為了評估VTPY對健康及受乙醇損傷的GES-1細胞存活率的影響，對細胞進行了不同濃度的VTPY處理（62.5～1000.0 μmol/L），無論是在存在4%乙醇（V/V）的情況下還是不存在乙醇的情況下。對正常GES-1細胞進行125和250 μmol/L VTPY處理24 h后，發現細胞的存活率最初呈劑量依賴性增加，但隨后在高劑量下下降（圖1A）（P＜0.05）。在乙醇處理后，125和250 μmol/L VTPY的濃度被發現促進了GES-1細胞的生長，而OME則顯著恢復了GES-1細胞的增殖（P＜0.05）（圖1B）。結果表明，125和250 μmol/L VTPY對正常GES-1細胞和受乙醇損傷的GES-1細胞的生長均有促進作用。在其他濃度下未觀察到對細胞存活率的抑制作用。基于之前的實驗結果，在進一步的體外細胞試驗中選擇了較低濃度（62.5、125.0和250.0 μmol/L的VTPY）。

圖1 VTPY促進細胞增殖、遷移和血管生成

VTPY加速GES-1細胞和HUVEC細胞的運動

為了評估VTPY對正常GES-1細胞以及乙醇損傷的GES-1和HUVEC細胞運動的影響，這些細胞在存在或不存在乙醇的情況下分別暴露于低、中和高劑量的VTPY（62.5、125.0和250.0 μmol/L）。很明顯，隨著時間的推移，健康GES-1細胞的傷口閉合在中、高劑量VTPY組中加速，與未處理組相比（P＜0.05）（圖1C和F）。在暴露于乙醇后，與對照組相比，模型組細胞遷移能力顯著下降，從（76.0±3.5）%降至（61.0±7.8）%（P＜0.05）。然而，在中、高劑量VTPY處理后，細胞遷移能力顯著提高，分別達到（76.6±0.7）%和（82.0±5.8）%（P＜0.05）（圖1D和G）。同樣，模型組中HUVEC細胞的傷口閉合率與對照組相比顯著下降，從（32.8±5.4）%降至（23.2±4.7）%（P＜0.05），VTPY濃度為125和250 μmol/L時，傷口閉合率顯著增加，分別為（33.5±4.6）%和（40.2±6.5）%（P＜0.05）（圖1E和H）。這些發現表明，VTPY能夠有效對抗乙醇引起的GES-1和HUVEC細胞的細胞遷移能力受損。

VTPY加速HUVEC細胞的血管生成過程

血管生成對于修復酒精損傷的胃組織至關重要，它能夠提供必要的營養物質和氧氣。先前的研究已經表明，VTPY可以有效促進正常HUVEC細胞的增殖、遷移和血管生成過程，這表明VTPY在促進血管再生方面具有潛力。為進一步評估VTPY對乙醇損傷HUVEC細胞血管生成過程的影響，在4%乙醇（V/V）存在下，使用低劑量、中劑量和高劑量的VTPY處理這些細胞。根據圖1I，模型組形成的管狀結構數量顯著低于對照組。這表明乙醇損傷后HUVEC形成管狀結構的能力降低。然而，VTPY可以逆轉這一過程，促進體外血管生成，這在修復酒精損傷引起的胃部損傷方面可以發揮重要作用。

VTPY減少乙醇刺激下的GES-1細胞和HUVEC細胞中的ROS生成

氧化應激被認為是胃損傷的一個重要因素。評估了乙醇刺激下GES-1和HUVEC細胞中的ROS水平（圖2A和E）。與對照組中的綠色熒光強度（GES-1細胞中為7.0±1.5，HUVEC細胞中為9.7±1.2）相比，模型組中ROS水平顯著增加（GES-1細胞中為25.6±2.1，HUVEC細胞中為28.0±1.9）（P＜0.05；圖2C和G）。相比之下，VTPY低劑量、中劑量和高劑量組（62.5、125.0和250.0 μmol/L）以及OME組的DCF熒光強度與模型組相比分別降低至19.6±3.2、14.8±0.8、12.4±1.1和13.9±0.9（P＜0.05，圖2A和C）。與模型組相比，VTPY組（62.5、125.0和250.0 μmol/L）和OME組HUVEC細胞的熒光強度分別降低至15.8±1.4、14.0±2.1、10.4±0.8和13.25±1.40（P＜0.05，圖2E和G）。這些結果表明VTPY可能消除GES-1和HUVEC細胞的ROS損傷。此外，線粒體不僅是細胞ROS產生的主要場所，也是ROS損傷的重要靶點。MitoSOX紅色探針被用于進一步評估VTPY在細胞線粒體中的ROS清除能力。與對照組（11.5±0.4）相比，模型組（25.1±0.7）中的MitoSOX表達顯著升高，這表明在GES-1細胞中，乙醇誘導產生的線粒體ROS水平顯著增加（P＜0.05，圖2B和D）。與模型組相比，所有VTPY組和OME組均表現出顯著降低的MitoSOX熒光強度（分別為62.5、125.0和250.0 μmol/L VTPY組的16.1±0.5、15.2±0.8和13.2±0.6，以及OME組的15.9±0.5）（P＜0.05，圖2B和D）。此外，在HUVEC細胞中也觀察到類似結果（P＜0.05，圖2F和H）。因此，推測VTPY通過清除ROS可能有助于緩解因ROS過度產生而導致的線粒體損傷。

圖2 VTPY對乙醇受損GES-1細胞和HUVEC細胞ROS清除能力的影響

VTPY緩解線粒體分裂并恢復線粒體形態

與模型組相比，模型組顯示相對線粒體面積減少，線粒體數量增加，出現不同大小的空泡，線粒體內膜褶皺數量減少，內空間（基質）電子密度降低（圖3A）。這些結果表明模型組促進了線粒體的分裂和損傷。然而，250 μmol/L VTPY處理后，線粒體的形態得以恢復，與模型組相比，小于0.5的相對線粒體面積比例顯著降低。對相對線粒體面積和形狀比進行了定量分析，以進一步研究VTPY對GES-1細胞線粒體形態的影響（圖3B-D）。圖3D中的散點圖顯示模型組中相對線粒體面積和形狀比的顯著降低（P＜0.05）。然而，VTPY顯著改善了這些條件。線粒體通過為細胞生長和運動提供ATP，在組織修復中發揮關鍵作用。經歷氧化應激損傷后，線粒體的異常形態和功能可能阻礙GES-1細胞的適應性修復。這是因為氧化磷酸化主要發生在線粒體嵴中，線粒體中液泡的存在可能會減少ATP的產生，從而顯著影響能量代謝。結果表明，VTPY可以減輕線粒體過度裂變，調節線粒體形態，并改善乙醇對GES-1和HUVEC細胞的損傷。為了研究VTPY對GES-1和HUVEC細胞線粒體結構和細胞運動的潛在影響，對Tomm 20和F-肌動蛋白進行了免疫熒光共定位分析。F-肌動蛋白在細胞動員中起著至關重要的作用，而Tomm 20用于標記線粒體。如圖3E和F所示，模型組在GES-1和HUVEC細胞中表現出較低的F-肌動蛋白熒光強度，但比對照組表現出更多的小圓形線粒體碎片（紅色熒光），表明乙醇不僅誘導線粒體裂變，而且誘導F-肌動蛋白解聚，這可能解釋了GES-1和HUVEC細胞遷移減少的原因。然而，VTPY顯著緩解了線粒體的分裂，并增加了F-肌動蛋白的水平（圖3E和F）。因此，VTPY可能通過抑制線粒體分裂來抑制F-肌動蛋白的解聚，從而改善乙醇損傷的GES-1和HUVEC細胞的細胞運動能力。

圖3 250 μmol/L VTPY可恢復線粒體的形態并緩解F-肌動蛋白的降解

使用Mdivi-1（線粒體分裂抑制劑）來進一步評估VTPY、過度線粒體分割和F-肌動蛋白去聚合之間的關系。圖中的發現4A表明乙醇導致GES-1細胞線粒體片段增加和F-肌動蛋白熒光強度下降（20.2±2.3）。然而，這些效應被逆轉時，與Mdivi-1和250 μmol/L VTPY處理。用VTPY處理后，Mdivi-1和VTPY+Mdivi-1，F-肌動蛋白熒光分別升高到38.9±0.6、39.0±1.4和46.2±4.3（圖4B，P＜0.05）。所展示的結果提供了額外的證據支持VTPY可以通過改善乙醇引起的過度線粒體分裂來減少F-肌動蛋白的分解。鑒于線粒體形態在細胞生長、運動和能量生產中的重要性，假設VTPY可能有助于線粒體能量代謝。

圖4 250 μmol/L VTPY通過抑制過量線粒體分裂并恢復線粒體的形態和生物能量學缺陷，逆轉F-肌動蛋白解聚

為了研究VTPY對線粒體呼吸能力的影響，用海馬XF分析儀檢測乙醇處理的GES-1細胞在250 μmol/L VTPY處理后的氧消耗率（OCR）。根據圖中的結果4C，與對照組相比，模型組的OCR值顯著降低。然而，使用VTPY治療顯著緩解了這種減少（P＜0.05）。此外，研究還觀察到，與對照組相比，模型組GES-1細胞的各種有氧呼吸功能指標顯著下降。這些指標包括基礎呼吸、ATP合成、最大呼吸和質子泄漏。然而，在使用VTPY治療后，這些指標被逆轉并顯示出改善。這些指標中，線粒體的ATP合成能力尤為重要。模型組的ATP生成量比對照組減少26.43%（P＜0.05）。然而，與模型組相比，VTPY組和OME組的ATP生成量分別增加了60.74%和33.03%（P＜0.05，圖4D）。此外，結果顯示，模型組導致GES-1細胞中NADH/NAD+比值顯著增加，表明線粒體處于過氧化和電子轉運鏈損傷的狀態，而VTPY治療可以恢復NAD+和NADH的穩態（P＜0.05，圖4E）。VTPY對乙醇誘導的GES-1細胞損傷的益處與逆轉過量的線粒體裂解、抑制F-肌動蛋白脫聚、改善OCR和促進ATP生成有關。

VTPY改善了酒精損傷細胞中線粒體動力學相關因子的表達

鑒于線粒體的結構和功能發生了重大變化（圖3），探索了VTPY可能通過哪些機制緩解乙醇引起的過量線粒體分裂。研究重點放在了幾種參與維持線粒體動態平衡的細胞因子上，即Fis 1、Drp 1和Mfn2。測量了GES-1細胞中Fis 1、Drp 1和Mfn2的水平，以評估VTPY的線粒體調節能力。根據圖4F-H所示的結果，觀察到模型組的Fis 1和Drp 1表現出顯著的上調，而與對照組相比，Mfn2水平顯著下降（P＜0.05）。這表明乙醇通過調節這些線粒體動態平衡細胞因子來促進GES-1細胞中的線粒體外周裂變。相比之下，VTPY處理組的Fis 1和Drp 1表達顯著降低，同時Mfn2水平升高。研究結果表明，VTPY治療可以通過調節這些與線粒體動態相關的細胞因子，來恢復線粒體的形態并減輕乙醇處理后受損的GES-1細胞中線粒體的過度分裂現象。

VTPY通過抑制與線粒體相關的凋亡途徑，減輕了乙醇對GES-1細胞和HUVEC的損傷

除了作為細胞能量代謝的調控中心外，線粒體還作為細胞凋亡的調控中心發揮著關鍵作用。為了研究VTPY對GES-1和HUVEC細胞線粒體膜電位和細胞凋亡的潛在影響，使用了Mito-Tracker Red CMXRos和Annexin V-FITC探針。與對照組相比，模型組顯示紅色熒光強度降低，綠色熒光強度增加。基于這一觀察結果，可以推斷乙醇導致GES-1和HUVEC細胞的線粒體膜電位顯著降低，并觸發細胞凋亡（圖5A和B）。相比之下，VTPY明顯改善了這種表現（圖5A-F）。此外，Ca2+在維持線粒體膜電位方面起著關鍵作用。Ca2+濃度的增加會導致過量的活性氧物種產生，并迅速降低線粒體的膜電位。因此，Cyt-C會從線粒體中釋放出來，觸發細胞內Ca2+凋亡。本研究中，模型組內的GES-1細胞內Ca2+濃度顯著增加，與對照組相比（圖5G）。然而，VTPY處理組和OME處理組均顯示Ca2+水平顯著降低（P＜0.05）。

與對照組相比，乙醇誘導的線粒體功能障礙在GES-1和HUVEC細胞中將更多的Cyt-C從線粒體釋放到細胞質中，甚至部分Cyt-C在細胞核中遷移，增加了凋亡前Bax和cleaved-caspase-3的表達水平，并下調了Bcl-XL蛋白的表達水平（圖5H-L）。此外，VTPY或OME治療顯著抑制了GES-1和HUVEC細胞中Cyt-C向細胞質的滲漏，下調了Bax和cleaved-caspase-3蛋白表達水平，以及上調了Bcl-XL蛋白表達水平。特別是，高劑量VTPY治療使Bax和cleaved-caspase-3的蛋白表達分別減少83.1%和58.2%，并使Bcl-XL的蛋白表達增加76.8%。總的來說，VTPY通過改善細胞內Ca2+的穩態來恢復線粒體膜電位，下調促凋亡蛋白和上調抗凋亡蛋白來促進細胞存活。

圖5VTPY通過抑制線粒體裂變相關線粒體凋亡途徑來修復乙醇損傷

圖5 VTPY通過抑制線粒體裂變相關線粒體凋亡途徑來修復乙醇損傷

在接下來的研究中，研究了乙醇誘導的線粒體過度分裂對GES-1細胞凋亡過程的影響。先前的研究表明，過度的線粒體裂解可能觸發與線粒體相關的凋亡。為了進行更深入的研究，利用線粒體分裂抑制劑-1/Mdivi-1，結合GreenNucTM（檢測caspase-3活性的探針）和Annexin V-mCherry（指示細胞凋亡的探針），來研究VTPY、線粒體裂解和細胞凋亡發作之間的關系。根據圖6A所示的結果，模型組與未處理組相比，綠色和紅色熒光水平明顯升高。這一觀察表明，乙醇通過激活caspase-3促進細胞凋亡。相反，觀察到在250 μmol/L VTPY、Mdivi-1和VTPY和Mdivi-1聯合治療時，caspase-3活性顯著降低，細胞凋亡的改善（圖6A至C）。這些結果進一步表明，乙醇誘導的線粒體過度分裂可以激活細胞凋亡，而VTPY治療可以通過抑制線粒體的夸大裂解來減輕凋亡。

雖然VTPY對乙醇誘導的細胞凋亡的抑制作用已經被證明，但需要更多的研究來全面了解其細胞保護和修復特性。為了解決這個問題，使用PAC-1（caspase-3激活劑）和Ac-DEVD-CHO（caspase-3抑制劑）進行了實驗，以研究VTPY是否可以通過抑制細胞凋亡來促進GES-1細胞的恢復。根據圖6A-C所示的發現。乙醇誘導組與對照組相比，caspase-3活性和細胞凋亡顯著增加。在接受VTPY和Ac-DEVD-CHO治療后，這些效應被顯著抑制。相反，PAC-1治療的引入增加了caspase-3活性和細胞凋亡。然而，在分析PAC-1組時，VTPY和PAC-1的聯合使用顯示caspase-3活性和細胞凋亡顯著降低。此外，圖6D表明，當暴露于乙醇時，GES-1細胞的存活率顯著下降。然而，當使用VTPY和Ac-DEVD-CHO時，活性有所改善，這表明VTPY有潛力通過減少酒精誘導的細胞凋亡來增強細胞存活。VTPY和Ac-DEVD-CHO的聯合應用顯著提高了GES-1細胞的存活率。相反，與模型組相比，PAC-1組的存活率進一步下降。然而，當VTPY和PAC-1結合時，細胞的活力顯著增強，與單獨使用PAC-1相比，表現出顯著的改善（圖6D）。綜上所述，VTPY通過減少線粒體介導的凋亡，有效抵消了GES-1細胞的乙醇損傷。

圖6 VTPY通過抑制過度的線粒體分裂來誘導細胞凋亡，從而修復乙醇處理后的GES-1細胞損傷

圖7 VTPY減輕乙醇誘導的線粒體功能障礙和細胞損傷的機制

VTPY改善小鼠乙醇誘導的胃損傷

為了研究VTPY是否能修復小鼠乙醛誘導的急性胃損傷，建立了一個急性乙醇誘發胃損傷模型（圖8B）。宏觀觀察顯示，對照組小鼠無明顯病變，而模型組小鼠胃組織變薄，有明顯的充血和發紅區域，說明胃損傷尚未完全愈合。研究發現，用OME和VTPY治療小鼠乙醇刺激引起的胃粘膜損傷顯著改善，VTPY表現出劑量依賴性效應。與VTPY-L組相比，VTPY-M組胃組織充血和發紅現象較少。宏觀上，VTPY-H組和OME組的胃組織沒有表現出與對照組相似的紅腫或潰瘍的跡象（圖8B）。圖8C介紹了小鼠胃潰瘍指數的評價。結果表明，與模型組相比，VTPY組和OME組顯著降低了潰瘍指數的增加。因此，可以得出結論，VTPY對改善乙醇誘導的胃損傷有積極作用。圖8D顯示體質量隨時間的變化。除對照組外，其他組的體質量先下降后增加。到第4天，VTPY-H組和OME組的體質量顯著高于模型組（P＜0.05）。然而，VTPY-M組和VTPY-L組與模型組之間沒有統計學顯著差異。在受傷后的第二天，每個實驗組由于胃損傷導致食物攝入減少而出現體質量減輕。隨著時間的推移，每組的胃組織逐漸恢復，導致體質量增加。VTPY-H組和OME組的恢復效果最好，與模型組相比，體質量比更高（P＜0.05）。上述研究結果表明，VTPY有潛力有效減輕小鼠乙醇性胃粘膜損傷。

VTPY恢復乙醇損傷胃組織的病理特征

圖8E展示了掃描電鏡在評估胃上皮細胞表面形態學中的應用。與對照組相比，模型組胃黏膜表現出明顯的凹陷滲透，表明胃黏膜損傷未完全恢復。然而，經過不同劑量的VTPY治療后，病情逐漸好轉。VTPY-H組和OME組恢復較好，更接近對照組，胃淺表黏膜穿孔消失。為了進一步評估VTPY對胃組織損傷的有效性，采用HE染色，如圖8F。結果顯示，正常組胃黏膜表現為腺體和細胞厚實且排列規則，無任何可見的炎癥或水腫跡象。然而，在乙醇治療組中，出現了上皮脫落（紅箭）、胃黏膜變薄、腺體結構破壞（黑箭）、黏膜下水腫（藍箭）和炎性細胞浸潤（橙箭）。服用VTPY可顯著改善這些癥狀，并促進血管形成（綠色箭頭）。VTPY-H組在促進胃粘膜修復方面表現出顯著的有效性。該組顯示上皮細胞和細胞間隙的脫屑減少，炎癥細胞的浸潤減弱，血管的形成增加。這些研究結果表明，VTPY-H可以在很大程度上修復胃黏膜。

圖8 VTPY對酒精誘導胃損傷小鼠癥狀的影響

VTPY治療增強了受乙醇損傷的小鼠胃組織中的血管生成

在體外實驗結果中，觀察到VTPY增強了乙醇損傷的HUVEC細胞的遷移和血管生成。此外，通過HE染色分析，乙醇損傷的胃組織中血管生成的增加。為了更深入地了解這一現象，進行了CD31和VEGF免疫熒光分析。免疫熒光結果顯示，與對照組相比，乙醇治療組的綠色熒光（VEGF）和紅色熒光（CD31）有所下降。這表明乙醇損傷導致VEGF表達和血管形成分布的減少（圖9A-C），這些結果與體外血管生成實驗和HE染色結果一致（圖1I和圖8F）。值得注意的是，與乙醇治療組相比，VTPY-H組表現出更高的血管生成水平，這可以通過CD31標記的紅色熒光更大的發光結構來證明。此外，發現VEGF和CD31在VTPH-H組的組織中分布和表達更廣泛（圖9A-C）（P＜0.05）。使用蛋白質印跡來研究VEGFA和VEGFR2的表達（圖9D和E）。研究結果顯示，與對照組相比，乙醇治療組胃組織中的VEGFA和VEGFR2蛋白水平顯著下降（P＜0.05）。然而，VTPY-H的治療導致了VEGFA和VEGFR2蛋白表達的增加。這表明VTPY可以通過促進VEGF相關蛋白的表達來增強乙醇損傷的HUVEC細胞的遷移和血管生成。總之，VTPY通過上調VEGF相關蛋白促進乙醇損傷胃組織中的血管生成，從而促進胃組織修復。

圖9 VTPY對小鼠酒精損傷后胃組織內血管生成的影響

VTPY對小鼠因乙醇引起的胃損傷的生化指標的影響

鑒于觀察到的炎癥細胞浸潤，進一步測量MPO水平以評估中性粒細胞浸潤的程度。乙醇刺激導致MPO活性顯著增加，與對照組相比達到2.45倍（圖10A）。研究發現，VTPY-L、VTPY-M、VTPY-H和OME處理組中MPO含量分別減少38.5%、53.6%、57.9%和62.2%。有趣的是，VTPY-H和OME治療組之間沒有顯著差異，這表明VTPY是有效的中性粒細胞進入胃組織抑制劑。此外，IL-6是一種趨化因子，能夠吸引炎癥細胞，導致炎癥介質的產生和釋放，從而加重急性胃損傷。TNF-α與炎癥細胞協同作用，進一步加劇小鼠胃黏膜損傷，同時IL-6和TNF-α的過表達均可阻礙胃組織的愈合。與對照組相比，乙醇刺激導致IL-6和TNF-α的表達增加。然而，使用VTPY和OME處理后，IL-6和TNF-α的表達顯著降低，特別是VTPY-H對IL-6和TNF-Α的抑制率分別為38.7%和39.3%（圖10B和C）。這些結果表明，VTPY能有效緩解酒精攝入引起的胃組織炎癥反應。此外，NFκB p65蛋白是炎癥基因的關鍵調節因子，可以刺激炎癥細胞因子的表達。蛋白質印跡檢測結果顯示胃組織中p-IκB-α、p-NFκB p65和iNOS的蛋白表達水平。模型組p-IκB-α、p-NFκB p65和iNOS表達水平顯著升高，分別是對照組的1.63、1.62和2.77倍（P＜0.05）（圖10D-F）。然而，VTPY和OME治療顯著逆轉了這些現象。這表明VTPY肽可以抑制NF-κB通路相關蛋白，并部分降低NF-κB信號通路的激活和炎癥反應。

圖10 VTPY對酒精損傷后胃組織炎癥及小鼠血清和胃組織氧化抗氧化系統的影響

VTPY處理減少了小鼠血清和胃組織中的氧化應激

MDA是一種標志物，反映身體細胞被自由基攻擊的嚴重程度，它是另一個重要的因素。MDA含量的降低可以反映出胃黏膜損傷的改善。模型組中組織勻漿和小鼠血清中還原型谷胱甘肽的水平顯著低于對照組。具體來說，水平從（24.6±2.7）下降到（8.7±3.1）μmol/g pro，從（141.9±23.0）下降到（68.2±8.8）μmol/L（圖10G和K）。此外，模型組中組織勻漿和小鼠血清中的MDA水平均有所增加。小鼠血清組織勻漿中的水平從（0.4±0.2）增加到（2.0±0.4）nmol/L，并且從（3.5±0.7）增加到（14.5±2.0）nmol/L（圖10H和L）。這些結果表明模型組氧化應激增加，且胃黏膜損傷尚未愈合。與模型組相比，VTPY和OME處理均顯著提高了胃組織和血清中的還原型谷胱甘肽水平，同時降低了MDA含量。VTPY-H和OME組顯示出特別有希望的結果，其水平恢復到接近對照組的水平。這些結果表明，由VTPY介導的胃組織和血清中還原型谷胱甘酞和MDA水平的增加，可能有助于乙醇誘導的小鼠胃損傷的修復。

根據圖10I、J、M和N所示的結果，模型組小鼠的勻漿液和血清中CAT和SOD的活性與對照組相比顯著下降（P＜0.05）。酶活性下降可能解釋了模型組MDA水平升高的情況。與模型組相比，VTPY組小鼠組織勻漿液和血清中CAT及SOD的活性呈劑量依賴性增加（P＜0.05），且高劑量組與OME組部分相似，這表明VTPY治療增強了氧化酶活性，從而改善了乙醇誘導的脂質過氧化作用。

VTPY治療改善了小鼠胃組織中的線粒體裂解

炎癥和過氧化都會導致線粒體損傷并引發細胞凋亡。之前的體外實驗表明，VTPY有能力減輕乙醇損傷的GES-1細胞的線粒體過度裂解和功能障礙。現在正在研究VTPY對小鼠胃組織線粒體的影響。圖11A-C顯示Fis 1和Drp 1顯著上調，而與對照組相比，乙醇處理組的Mfn2水平顯著下降（P＜0.05）。這項研究的結果證實了乙醇誘導的胃組織損傷會導致線粒體過度裂變。然而，VTPY治療有效地逆轉了這些現象，與在GES-1細胞中觀察到的結果一致。此外，進一步測定了線粒體呼吸復合物Ⅱ（SDH酶）的活性（圖11D）。乙醇處理組的SDH活性從（54.4±7.3）下降到（17.6±3.6）U/mg pro。與乙醇處理組相比，VTPY-L、VTPY-M、VTPY-H和OME組的SDH活性分別為（29.5±5.6）、（40.2±3.9）、（48.9±6.17）和（56.5±6.2）U/mg pro，這進一步證實了VTPY處理對乙醇引起的胃組織線粒體損傷有改善作用。

圖11 VTPY對胃組織線粒體功能障礙的影響

VTPY通過抑制線粒體介導的凋亡途徑減輕乙醇引起的胃組織損傷

在先前的研究中，提供了VTPY通過逆轉GES-1細胞中過度線粒體裂解誘導凋亡的有效性證據。此外，在HUVEC細胞中觀察到了類似的結果。在這里，進一步驗證VTPY在體內環境中的效果。與對照組相比，圖12B和D在乙醇處理的模型組中Bcl-2和Bcl-XL的蛋白表達水平中表現出顯著的蛋白質減少。相反，乙醇處理組的Bax、Bad和cleaved caspase-3水平顯著上升（圖12A、C和F）。此外，模型組的Bcl-2/Bax和Bcl-XL/Bad蛋白表達率分別降至對照組的55.2%和36.2%（圖12E和G）。然而，在VTPY治療后，Bcl-2、Bcl-XL、Bax、Bad和cleaved caspase-3的蛋白表達水平，以及Bcl-2/Bax和Bcl-XL/Bad的比例，與模型組相比，表現出顯著的逆轉（P＜0.05）。這些發現表明，VTPY有潛力減輕乙醇誘導的胃損傷小鼠的線粒體介導的凋亡過程。這與體外實驗的結果一致。

圖12 VTPY對胃組織中與線粒體相關的凋亡途徑的影響

Conclusion

本研究的結果證實，VTPY具有顯著的能力，能夠減輕乙醇誘導的損傷對GES-1細胞和HUVEC細胞的不利影響。VTPY的有益作用包括促進細胞增殖和遷移、增強抗氧化/氧化平衡、減少線粒體和細胞內ROS的積累以及改善線粒體呼吸。此外，研究還表明，VTPY能夠通過調節Fis 1/Bcl-2途徑，對抗乙醇誘導的過量線粒體分裂，從而恢復線粒體形態，有效減輕細胞凋亡，促進胃黏膜的恢復和血管生成。本研究展示了VTPY在減輕酒精誘導的胃損傷方面的潛力，使其成為治療該疾病的潛在候選藥物。這些發現為開發基于食物的功能因子對抗乙醇誘導的胃損傷提供了新的見解。

Sea cucumber gut tetrapeptide ameliorates alcoholic gastric damage via restoring mitochondrial dynamics

Zhihong Zhenga,b,c, Na Suna,b,c, Jingqi Yanga,b,c, Zhijie Baoa,b,d, Songyi Lina,b,c,d,*

a State Key Laboratory of Marine Food Processing and Safety Control, School of Food Science and Technology, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China

b National Engineering Research Center of Seafood, School of Food Science and Technology, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China

c Collaborative Innovation Center of Seafood Deep Processing, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China

d Liaoning Engineering Research Center of Special Dietary Food, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China

*Corresponding author.

Abstract

This paper aimed to explore the mechanism of tetrapeptide Val-Thr-Pro-Tyr (VTPY) in improving alcoholic gastric injury. VTPY has the potential to enhance the growth and movement of normal human gastric epithelial cells (GES-1). Following ethanol-induced impairment, VTPY effectively improved migration of GES-1 and human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) cells, enhanced angiogenesis, eliminated cellular and mitochondrial reactive oxygen species (ROS), inhibited excessive mitochondrial division, enhanced F-actin polymerization and mitochondrial respiratory capacity. To counteract excessive mitochondrial fission, VTPY primarily restores the mitochondria dynamics by reducing the expression of Drp1 and Fis1, while increasing Mfn2. Further studies utilizing inhibitors clarifies that the inhibition of excessive mitochondrial fission can markedly reduce F-actin depolymerization, consequently enhancing cell migration. Additionally, VTPY can inhibit the apoptosis pathway by maintaining potential of mitochondrial membrane, preventing the release of mitochondrial cytochrome c, bolstering the levels of Bcl-XL, while reducing the levels of Bax and cleaved-caspase-3. Further investigations using inhibitors demonstrates that excessive mitochondrial fission could activate apoptotic pathway. However, VTPY counteracts this effect and enhance cells viability. Further evidence suggests that VTPY effectively improves ulcer index and pathologic changes, relieves inflammation, enhances the balance of oxidation and anti-oxidation, promotes angiogenesis, improves the expression of mitochondrial dynamics factors, blocks apoptotic pathway, and subsequently ameliorates gastric damage in mice through Fis-1/Bcl-2 pathway.

Reference:

ZHENG Z H, SUN N, YANG J Q, et al. Sea cucumber gut tetrapeptide ameliorates alcoholic gastric damage via restoring mitochondrial dynamics[J]. Food Science and Human Wellness, 2025, 14(5): 9250183. DOI:10.26599/FSHW.2024.9250183.

翻譯： 羅敬 （實習）

編輯：梁安琪；責任編輯：孫勇

封面圖片：攝圖網

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