FSHW | 3D生物打印中卵白蛋白/明膠生物墨水的制備及其在培養(yǎng)肉原位組織培養(yǎng)中的應(yīng)用

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Abstract

3D生物打印是一項新興的組織工程技術(shù)，其打印參數(shù)已得到升級優(yōu)化，能夠在細(xì)胞培養(yǎng)肉領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)深度應(yīng)用。然而，目前迫切需要開發(fā)適用于細(xì)胞培養(yǎng)肉的、兼具優(yōu)異可打印性與可食用性的生物墨水。為此，本研究開發(fā)了一種以卵白蛋白和明膠為基礎(chǔ)的低成本生物墨水。首先，通過流變學(xué)分析確定該生物墨水具備適宜的可打印性；同時，借助吸水率測試與降解速率測試，證實了由該生物墨水打印形成的支架具有出色的機(jī)械穩(wěn)定性。其次，通過細(xì)胞增殖培養(yǎng)、細(xì)胞狀態(tài)研究以及組學(xué)分析，明確了該支架的生物相容性及其與細(xì)胞間的相互作用機(jī)制。值得注意的是，AG7展現(xiàn)出更優(yōu)的可打印性，而AGS7則為細(xì)胞黏附、增殖與遷移提供了更有利的微環(huán)境。S型指數(shù)生長曲線進(jìn)一步表明，AGS7支架在細(xì)胞培養(yǎng)方面具有顯著優(yōu)勢。更為重要的是，本研究將肌肉細(xì)胞的組織培養(yǎng)過程模擬拓展至類器官培養(yǎng)層面，闡明了細(xì)胞與支架之間相互作用的關(guān)鍵信息。該研究成果填補(bǔ)了行業(yè)內(nèi)相關(guān)領(lǐng)域的空白，為細(xì)胞培養(yǎng)肉的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)開發(fā)提供了一種全新策略。

Introduction

細(xì)胞培養(yǎng)肉，又稱生物培養(yǎng)肉，是近年來興起的一種顛覆性肉類生產(chǎn)技術(shù)。目前，大多數(shù)培養(yǎng)肉以肉餡形式存在，業(yè)界普遍認(rèn)為，采用組織工程技術(shù)構(gòu)建3D肌肉組織或?qū)⒊蔀榻鉀Q這一問題的理想方案。3D生物打印作為一種通用工程技術(shù)，可用于制備具有特定結(jié)構(gòu)和形狀的3D構(gòu)建體。通過計算機(jī)輔助設(shè)計，能夠精準(zhǔn)控制細(xì)胞與生物材料的排布位置，進(jìn)而逐層快速構(gòu)建出與天然組織相似的人工組織結(jié)構(gòu)。盡管3D生物打印技術(shù)在人工組織構(gòu)建領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊前景，但其生物墨水存在的可打印性差、可食用性不佳等問題，卻限制了該技術(shù)在細(xì)胞培養(yǎng)肉領(lǐng)域的應(yīng)用——這些問題易導(dǎo)致構(gòu)建體結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，并帶來生物安全性風(fēng)險。此外，細(xì)胞的黏附、增殖及遷移效果也與生物墨水的性能密切相關(guān)。因此，開發(fā)具備優(yōu)異可打印性與生物相容性的生物墨水，對于構(gòu)建理想的3D肌肉組織至關(guān)重要。

根據(jù)近期部分研究，卵白蛋白是一種可食用且成本低廉的生物大分子。因其含有卵清蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、卵類黏蛋白等多種成分，有助于細(xì)胞黏附與增殖，進(jìn)而可提升所制備支架的整體生物相容性，并促進(jìn)細(xì)胞增殖與黏附。因此，卵白蛋白可被視為制備生物墨水的潛在可用材料。然而，由于卵白蛋白含水量高且化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，其自身不具備可打印性，需與其他成分復(fù)配使用。明膠是一類已知的大分子親水性膠體，由膠原蛋白部分水解制得。憑借適宜的流變特性與優(yōu)異的生物相容性，明膠被廣泛應(yīng)用于基于擠出成型的3D生物打印中，用于制備細(xì)胞支架。但遺憾的是，明膠具有溫度敏感性相變特性：當(dāng)溫度升至25～35 ℃時，明膠易從凝膠態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槿芤簯B(tài)。這種特性對支架的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性保持構(gòu)成了重大挑戰(zhàn)。因此，通過物理或化學(xué)方法對明膠基支架進(jìn)行交聯(lián)處理以提升其穩(wěn)定性，是十分必要的。

圖1 （A）卵白蛋白/明膠墨水的制備及三維支架打印與交聯(lián)流程示意圖；（B）不同墨水的流變學(xué)特性；（C）三維打印支架的掃描電鏡圖像

本研究中，如圖1A所示，通過將明膠溶液與卵白蛋白混合，制備出一種新型復(fù)合生物墨水，并利用3D打印技術(shù)構(gòu)建了支架。打印完成后，研究采用低濃度戊二醛進(jìn)行支架固化：戊二醛可與（支架材料中）賴氨酸和羥賴氨酸殘基的ε-氨基發(fā)生反應(yīng)，形成席夫堿，進(jìn)而進(jìn)一步提升支架的穩(wěn)定性。研究通過流變學(xué)分析評估該生物墨水的適宜可打印性，具體分析指標(biāo)包括儲能模量（G’）、損耗模量（G”）及剪切變稀行為；同時，通過可打印性測試進(jìn)一步驗證了生物墨水的打印性能。此外，借助吸水率測試與降解速率測試，對支架的機(jī)械穩(wěn)定性進(jìn)行了評估。最后，為將該支架應(yīng)用于肌肉細(xì)胞的組織培養(yǎng)，研究通過細(xì)胞增殖培養(yǎng)、細(xì)胞狀態(tài)分析及組學(xué)分析，系統(tǒng)評估了支架的生物相容性及其與細(xì)胞間的相互作用。本研究為利用3D生物打印支架生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)肉提供了一種新方法。

Results and Discussion

生物墨水的流變學(xué)分析

為制備可用于打印的生物墨水，本研究將從新鮮雞蛋中提取的純卵白蛋白與不同濃度（2.5%、5.0%、7.5%、10.0%）的明膠溶液混合攪拌，得到均一液態(tài)的混合物，用于后續(xù)表征實驗。

首先，通過流變學(xué)分析對所制備生物墨水的流變特性進(jìn)行評估。如圖1B1所示，當(dāng)剪切速率從0.1 s?1增至100 s?1時，所有生物墨水的黏度均呈下降趨勢，表現(xiàn)出典型的剪切變稀特性。此外，隨著明膠含量的增加，生物墨水的黏度顯著升高。

如圖1B2和B3所示，所有生物墨水的儲能模量與損耗模量均在4～40 ℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行了表征。在整個測試溫度區(qū)間內(nèi)，所有生物墨水的儲能模量均持續(xù)高于損耗模量，這表明生物墨水始終維持著穩(wěn)定的類凝膠狀態(tài)。此外，值得注意的是，AG5、AG7和AG10的儲能模量在約15 ℃時出現(xiàn)顯著下降，這一現(xiàn)象歸因于溫度升高導(dǎo)致明膠分子間氫鍵作用減弱。該結(jié)果表明，更高濃度的明膠有助于提升生物墨水的穩(wěn)定性。

3D打印支架的制備與表征

通過流變學(xué)分析，已證實所制備生物墨水具備剪切變稀特性與機(jī)械穩(wěn)定性。隨后，研究將該生物墨水用于3D打印以構(gòu)建支架。具體流程如下：將制備好的生物墨水裝入注射器中進(jìn)行3D打印，同時加入低濃度戊二醛溶液（0.25%）進(jìn)行交聯(lián)處理，最終成功制備出AGS2、AGS5、AGS7 和 AGS10 系列支架，用于后續(xù)表征實驗。

本研究采用掃描電鏡對所有支架的表面及內(nèi)部形貌進(jìn)行表征分析。如圖1C所示，經(jīng)戊二醛交聯(lián)后，所有支架的表面形貌均呈現(xiàn)出穩(wěn)定的單層片狀結(jié)構(gòu)，且支架內(nèi)部具有多孔結(jié)構(gòu)。通過測量可知，隨著明膠含量的增加，支架內(nèi)部孔徑顯著減小。

圖2 采用不同墨水進(jìn)行三維打印，并評估三維打印支架的力學(xué)性能

如圖2A所示，研究人員采用多種生物墨水，通過基于擠出成型的3D打印機(jī)構(gòu)建3D結(jié)構(gòu)。如圖2B所示，隨著明膠含量的增加，打印結(jié)構(gòu)的Pr值從0.76逐步升高至1.19。值得注意的是，AGS7的Pr值接近1，這表明明膠在一定程度上對提升可打印性具有積極作用。

如圖2C所示，生物墨水打印絲束的厚度先降低后升高。其中，AG7表現(xiàn)出更低的厚度分布差異，且其絲束厚度更接近打印頭直徑，這有利于實現(xiàn)均勻擠出并獲得更高的打印質(zhì)量。綜上，結(jié)果表明AG7生物墨水具有更優(yōu)異的打印性能，且適當(dāng)增加明膠含量對提升生物墨水的可打印性與均勻性具有積極影響。

如圖2D所示，所有支架均表現(xiàn)出顯著的吸水能力。其中，AGS2支架的溶脹率最高，AGS10支架的溶脹率最低，這一差異主要歸因于二者內(nèi)部孔徑的不同。

如圖2E所示，研究人員對各支架在磷酸鹽緩沖液中的降解性能展開了測試：在初始5～10 d內(nèi)，由于支架基質(zhì)中未交聯(lián)的明膠與卵白蛋白發(fā)生溶解，所有支架均呈現(xiàn)出加速降解的特征；而在10～40 d期間，其質(zhì)量損失速率逐漸減緩。值得注意的是，在磷酸鹽緩沖液中培養(yǎng)至40 d時，AGS2支架的結(jié)構(gòu)完整性損失最大，AGS10支架的結(jié)構(gòu)完整性損失最小。上述結(jié)果表明，高濃度明膠溶液更易與戊二醛發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)。如圖2F所示，研究發(fā)現(xiàn)吸水能力與明膠濃度的升高呈顯著負(fù)相關(guān)（相關(guān)系數(shù)為-0.97），而打印性能與明膠濃度的升高呈顯著正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)為0.97）。同時可觀察到，兩條相關(guān)性曲線均呈線性，這進(jìn)一步表明：隨著明膠濃度的增加，支架的吸水能力下降，而生物墨水的打印性能提升。

成肌細(xì)胞生物打印與細(xì)胞培養(yǎng)

研究人員選取AGS5、AGS7和AGS10三種生物墨水開展進(jìn)一步的成肌細(xì)胞打印研究。為評估3D生物打印支架的生物相容性，研究人員觀察了支架培養(yǎng)7 d后的活/死細(xì)胞染色結(jié)果，并采用CCK-8法監(jiān)測了第1天至第7天的細(xì)胞增殖情況。如圖3A所示，所有支架均表現(xiàn)出優(yōu)異的生物相容性，活細(xì)胞比例接近98%。尤為重要的是，與AGS10相比，AGS5和AGS7支架內(nèi)的細(xì)胞分布更均勻，且這兩組支架中的細(xì)胞在形態(tài)上呈現(xiàn)出更明顯的梭形。此外，AGS7支架內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量顯著多于AGS5。AGS5、AGS7和AGS10的細(xì)胞增殖曲線結(jié)果顯示：AGS5與AGS10的增殖曲線（分別呈線性和拋物線形）均低于正常細(xì)胞增殖曲線，而AGS7的增殖曲線則與正常細(xì)胞增殖曲線一致；同時，第7天的細(xì)胞增殖結(jié)果表明，AGS7的細(xì)胞數(shù)量顯著多于AGS5和AGS10，這進(jìn)一步證實：與AGS5、AGS10相比，AGS7可促進(jìn)細(xì)胞增殖。綜上，AGS7支架在保持較高持水力的同時，具有更低的降解速率。這意味著AGS7既能保留更多細(xì)胞黏附位點，又能維持高效的營養(yǎng)物質(zhì)與氧氣交換，對細(xì)胞在支架內(nèi)的黏附、增殖及遷移均具有積極作用。

如圖3B所示，培養(yǎng)第1天的結(jié)果顯示，AGS5和AGS7的細(xì)胞貼壁效率顯著高于AGS10。且通過分析細(xì)胞倍增時間發(fā)現(xiàn)，AGS5和AGS7在培養(yǎng)第3天實現(xiàn)細(xì)胞倍增，并于第4天進(jìn)入細(xì)胞增殖的指數(shù)生長期，這一趨勢與正常細(xì)胞增殖曲線一致。與之相反，AGS10在整個細(xì)胞增殖周期內(nèi)均偏離正常細(xì)胞增殖曲線，不利于后期細(xì)胞的持續(xù)培養(yǎng)。值得注意的是，AGS5的線性增殖曲線在第4天出現(xiàn)線性偏離，這表明在增殖過程中，細(xì)胞遷移與再聚集受到材料的限制。綜上，通過研究不同材料比例下的細(xì)胞貼壁與增殖情況，本研究進(jìn)一步闡明了在細(xì)胞持續(xù)培養(yǎng)過程中，AGS7在細(xì)胞貼壁、細(xì)胞遷移、細(xì)胞增殖及細(xì)胞營養(yǎng)物質(zhì)交換方面所具備的優(yōu)勢。基于上述結(jié)果，研究人員選擇由AG7墨水制備的支架作為后續(xù)3D組織培養(yǎng)所用的支架。

圖3 采用不同墨水打印的各類支架及成肌細(xì)胞的生物相容性測試

3D生物打印支架的組織培養(yǎng)

如圖4A所示，將上述制備的AG7墨水與成肌細(xì)胞混合，制備得到細(xì)胞濃度為1×10? cells/mL的生物墨水，用于3D生物打印。在支架培養(yǎng)過程中，研究人員通過熒光顯微鏡（培養(yǎng)1～7 d）和顯微鏡觀察（培養(yǎng)1～15 d），進(jìn)一步分析細(xì)胞行為及增殖狀態(tài)。

如圖4B所示，支架內(nèi)的細(xì)胞表現(xiàn)出良好的增殖能力：初始細(xì)胞貼壁后，先在支架邊緣附近增殖。培養(yǎng)至第7天，細(xì)胞已完全覆蓋整個支架，且分布均勻，這進(jìn)一步表明該支架不僅具有良好的生物相容性，還對細(xì)胞貼壁與遷移無顯著不良影響。此外，在所有時間節(jié)點的觀察中，支架內(nèi)均未發(fā)現(xiàn)明顯死細(xì)胞，提示低濃度戊二醛短期交聯(lián)處理對細(xì)胞狀態(tài)無顯著影響。

如圖4C所示，對單位面積細(xì)胞數(shù)量的分析結(jié)果顯示：支架內(nèi)細(xì)胞在培養(yǎng)第3天后進(jìn)入增殖指數(shù)生長期，第7天時單位面積細(xì)胞數(shù)量達(dá)到562 cells/mm2。

如圖4D所示，支架內(nèi)細(xì)胞在培養(yǎng)前7天快速增殖，這一結(jié)果與前述結(jié)論一致。值得注意的是，當(dāng)細(xì)胞持續(xù)增殖至第9天時，支架內(nèi)部空間被細(xì)胞填滿，細(xì)胞增殖受到支架空間限制，開始向支架外部溢出。此外，細(xì)胞通過細(xì)胞間連接在支架孔隙邊緣遷移并增殖：第11天時，孔隙邊緣的細(xì)胞連接形成線狀細(xì)胞簇；第13天時，支架孔隙邊緣的細(xì)胞開始沿周邊方向鋪展增殖，以線狀細(xì)胞簇為基礎(chǔ)形成開放的膜狀細(xì)胞組織；第15天時，支架孔隙內(nèi)形成完全閉合的膜狀細(xì)胞組織。

如圖4E所示，在細(xì)胞培養(yǎng)至第9天前，支架孔隙邊緣幾乎未出現(xiàn)膜狀細(xì)胞組織；第11～15天期間，膜狀細(xì)胞組織的形成速度加快，其面積增幅約為75%。由此可見，支架內(nèi)細(xì)胞的生長過程可分為三個階段：早期大量增殖并遷移；中期在支架孔隙內(nèi)以點狀和線狀形式增殖；最終在支架孔隙內(nèi)完成膜狀細(xì)胞組織的形成。

圖4 膜狀細(xì)胞組織的培養(yǎng)過程

2D與3D細(xì)胞培養(yǎng)的差異

3D生物打印完成后，支架內(nèi)細(xì)胞的增殖與遷移速度加快。在支架周邊區(qū)域，細(xì)胞展現(xiàn)出旺盛的增殖與遷移能力，最終在孔隙區(qū)域形成呈線性排列的細(xì)胞簇。這些線性排列的細(xì)胞逐漸擴(kuò)張并相互連接，最終形成閉合的膜狀細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)。顯微鏡觀察進(jìn)一步驗證了這一過程。轉(zhuǎn)錄組測序分析顯示，2D細(xì)胞培養(yǎng)與3D細(xì)胞培養(yǎng)存在明顯差異，二者相關(guān)系數(shù)為0.374。差異基因分析表明，兩種培養(yǎng)方式間存在3559個差異表達(dá)基因。韋恩圖分析進(jìn)一步揭示了2D與3D細(xì)胞培養(yǎng)中基因表達(dá)的重疊模式與獨特模式。為深入探究2D與3D細(xì)胞培養(yǎng)的差異，研究人員對兩類樣本的數(shù)據(jù)進(jìn)行分組，并對差異基因表達(dá)情況開展對比分析。利用兩種培養(yǎng)方式的數(shù)據(jù)進(jìn)行基因聚類熱圖分析（圖5A），結(jié)果顯示出不同的基因表達(dá)譜。

如圖5B所示，基因本體（GO）分析結(jié)果表明，與細(xì)胞黏附、遷移、增殖及細(xì)胞組織構(gòu)建相關(guān)的多種生物學(xué)過程、細(xì)胞組分及分子功能顯著富集。其中，鈣離子結(jié)合、細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合、細(xì)胞表面、細(xì)胞黏附、細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分及生長因子活性在這些生物學(xué)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在這些功能相關(guān)的差異表達(dá)基因中，顯著上調(diào)的基因包括Ltbp2、Olfml2b、Fbln2、Nid2、Col3a1、Bmp4、Fgf7、Inhbb、Lama4、Csta、Gpnmb、Nfasc、Npy2r、Bmp7、Megf10、Cdh20、Clstn2、Bnc1、Dsg2等。因此，研究推測，3D打印支架材料可在細(xì)胞黏附與增殖過程中促進(jìn)這些基因的表達(dá)，進(jìn)而改善細(xì)胞黏附與增殖效果。富集結(jié)果中，“通過質(zhì)膜黏附分子實現(xiàn)的同源細(xì)胞黏附”及“橋粒組裝”的主要功能是：借助質(zhì)膜上相同的黏附分子實現(xiàn)細(xì)胞附著，并促進(jìn)細(xì)胞間黏附及細(xì)胞連接的形成。京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析結(jié)果顯示，黏著斑通路與細(xì)胞周期信號通路顯著富集。

如圖5C所示，黏著斑通路中富集了68個調(diào)控基因，肌動蛋白細(xì)胞骨架調(diào)控通路中富集了59個基因，細(xì)胞周期通路中富集了43個基因，緊密連接通路中富集了33個基因，細(xì)胞黏附分子通路中富集了54個基因，鈣信號通路中富集了57個基因。

如圖5D所示，兩種培養(yǎng)方式間的主要差異表達(dá)基因包括Abi3bp、Cd36、Gpnmb、Apoa1、Ly6e、Csta、Rln1、Loc430862和Hps5。

如圖5E所示，實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）結(jié)果顯示，Ltbp2、Nid2、Bmp4、Pax7、Myod和Myog基因在3D細(xì)胞培養(yǎng)中表達(dá)量更高。這表明，3D培養(yǎng)可促進(jìn)關(guān)鍵基因的表達(dá)，從而對細(xì)胞增殖、黏附及細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)的形成產(chǎn)生積極影響，該結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果一致。

如圖5F所示，3D支架培養(yǎng)后期的免疫熒光結(jié)果顯示，細(xì)胞已完全覆蓋整個支架，且在支架孔隙內(nèi)形成了具有細(xì)胞間連接的多層膜狀細(xì)胞組織。

如圖5G所示，將支架內(nèi)細(xì)胞生長過程分為三個階段：第一階段為生物打印完成后細(xì)胞在支架內(nèi)的附著階段；中期為細(xì)胞在支架內(nèi)的增殖階段；后期為支架孔隙內(nèi)膜狀細(xì)胞組織的形成階段。qRT-PCR結(jié)果顯示，影響細(xì)胞黏附及組織形成的基因（Cdh20、Dsg2和Megf10）表達(dá)均顯著增強(qiáng)。值得注意的是，Cdh20基因持續(xù)高表達(dá)，而Dsg2和Megf10基因僅在培養(yǎng)后期表達(dá)量顯著升高。

PCR結(jié)果顯示，在培養(yǎng)后期，支架內(nèi)Pax7和Myod基因的表達(dá)水平顯著高于早期，這也證明細(xì)胞在組織結(jié)構(gòu)形成后期并未停止分裂，而是在支架孔隙內(nèi)持續(xù)增殖，進(jìn)而形成多層膜狀細(xì)胞組織。支架培養(yǎng)后期Fgf7基因的高表達(dá)同樣表明，此階段細(xì)胞仍未停止增殖。

如圖5H所示，蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，與培養(yǎng)早期相比，后期PAX7和MYOD蛋白的表達(dá)量顯著增加。因此，培養(yǎng)后期PAX7和MYOD的相對高表達(dá)表明，支架內(nèi)細(xì)胞的增殖行為尚未停止，同時細(xì)胞可能正在為分化及肌肉組織形成做準(zhǔn)備，這與基因表達(dá)結(jié)果及轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果一致。綜上，以卵白蛋白和明膠為主要成分的生物墨水不僅具有良好的生物相容性，還能積極調(diào)控支架內(nèi)細(xì)胞中與黏附、增殖相關(guān)的關(guān)鍵基因的表達(dá)，并誘導(dǎo)膜狀細(xì)胞組織的形成，表明其在培養(yǎng)肉細(xì)胞組織構(gòu)建支架領(lǐng)域具有潛在應(yīng)用價值。

圖5 二維與三維細(xì)胞培養(yǎng)的差異

支架懸浮培養(yǎng)與貼壁培養(yǎng)

本研究開展了支架貼壁培養(yǎng)與支架懸浮培養(yǎng)相關(guān)實驗。研究人員對兩種培養(yǎng)方式的樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并開展差異基因?qū)Ρ确治觥?/p>

如圖6A所示，基于兩種培養(yǎng)方式的數(shù)據(jù)進(jìn)行基因聚類熱圖分析，結(jié)果顯示出不同的差異表達(dá)基因。如圖6B所示，基因本體分析結(jié)果中主要富集的功能包括細(xì)胞外空間、微管馬達(dá)活性、微管結(jié)合、驅(qū)動蛋白復(fù)合物及含膠原蛋白的細(xì)胞外基質(zhì)。這些功能在維持細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞運(yùn)動、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸及細(xì)胞黏附等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮作用。這可能表明，懸浮培養(yǎng)樣本在細(xì)胞外基質(zhì)組成與相互作用、細(xì)胞信號傳導(dǎo)及細(xì)胞外環(huán)境方面與貼壁培養(yǎng)存在顯著差異。

如圖6C所示，KEGG富集結(jié)果顯示在黏著斑、細(xì)胞周期、甲狀腺激素信號通路、范可尼等顯著富集。

如圖6D所示，兩種培養(yǎng)方式間的差異基因包括Lgr5、Col9a、Map3k8、Fgf16、Nog、Cdk1、Ttk、Aaed1、Rcan2、Fancb、Fancf、Brca2等。由此可見，與支架貼壁培養(yǎng)相比，懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞增殖周期更短，能夠更早進(jìn)入組織培養(yǎng)后期階段，且懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞可能表現(xiàn)出更強(qiáng)的分化潛能。

如圖6E所示，qRT-PCR結(jié)果顯示，Cdk1和Ttk基因在培養(yǎng)中期表達(dá)量顯著升高，在后期表達(dá)量下降；而Lgr5和Map3k8基因在整個培養(yǎng)過程中均維持高表達(dá)。這表明，懸浮支架中的細(xì)胞在形成膜狀細(xì)胞組織之前，有絲分裂活動更為活躍。后期Cdk1和Ttk基因的低表達(dá)也提示，懸浮培養(yǎng)可能更早進(jìn)入組織培養(yǎng)后期階段。因此，Wnt/MAPK信號通路活性相對較高的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，更易發(fā)生細(xì)胞分化。綜上，為更好地模擬體內(nèi)細(xì)胞生長環(huán)境，并嘗試突破傳統(tǒng)貼壁培養(yǎng)的局限性，本研究對支架懸浮培養(yǎng)進(jìn)行了初步探索。結(jié)果表明，兩種培養(yǎng)方式在細(xì)胞增殖、附著、運(yùn)動及分化方面存在顯著差異，尤其是在細(xì)胞增殖與分化方面的差異，將成為未來研究的重點方向。

圖6 支架懸浮培養(yǎng)與貼壁培養(yǎng)的差異

Conclusion

綜上所述，為制備適用于細(xì)胞培養(yǎng)肉組織的可打印生物墨水，本研究開發(fā)了以卵白蛋白和明膠為原料的新型生物墨水，并成功制備出3D打印支架，同時對支架的形態(tài)、吸水性、打印性能、降解性及生物相容性進(jìn)行了表征。其中，AG7生物墨水展現(xiàn)出更優(yōu)異的可打印性；與此同時，S型指數(shù)生長曲線進(jìn)一步表明AGS7支架在細(xì)胞培養(yǎng)方面具有顯著優(yōu)勢。細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果顯示，成肌細(xì)胞在該支架內(nèi)可實現(xiàn)有效的黏附、增殖與遷移。更重要的是，通過3D細(xì)胞培養(yǎng)，研究成功構(gòu)建出類似類器官培養(yǎng)的肌肉細(xì)胞組織。此外，轉(zhuǎn)錄組學(xué)、qRT-PCR及Western blot分析結(jié)果表明，2D培養(yǎng)與3D培養(yǎng)在細(xì)胞附著、增殖及遷移過程中存在明顯差異；同時發(fā)現(xiàn)，3D培養(yǎng)可促進(jìn)與細(xì)胞間連接相關(guān)的基因（Cdh20、Dsg2、Megf10）的表達(dá)，進(jìn)而助力細(xì)胞組織的形成。總體而言，本研究為培養(yǎng)肉制造提供了一種新方法的可能性，表明3D細(xì)胞培養(yǎng)在細(xì)胞培養(yǎng)肉領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力。

Albumen/gelatin bio-inks preparation in 3D bio-printing for in situ tissue culture of cultured meat

Xiang Guoa,b, Feng Yanga, Yu Qia, Yingying Lia, Shouwei Wanga,*, Baohua Kongb,*

a China Meat Research Center, Beijing 100068, China

b College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China

*Corresponding author.

Abstract

Three-dimensional (3D) bio-printing is an emerging tissue engineering technology, and its printing parameters have been upgraded to enable in-depth application in cell-cultured meat. However, excellent printable and edible bio-inks for cell-cultured meat are in urgent need of development. Therefore, a low-cost bio-ink based on albumin and gelatin was developed. At first, suitable printability of the bio-ink was determined by rheology analysis, excellent mechanical stability, and excellent mechanical stability of the printed scaffold was also proved by water absorption and degradation rate. Next, the biocompatibility of the scaffold and its interaction with cells were clarified through cell proliferation culture, cell status research and omics analysis. Notably, AG7 demonstrated better printability and AGS7 provided better conditions for cell attachment, proliferation and migration, S-shaped exponential growth curve further revealed the significant advantages of AGS7 scaffolds in cell culture. More importantly, the tissue culture process of muscle cells was simulated to organoid culture, which elucidated the interaction information between cells and scaffolds. This work has filled the vacancy in the industry and provides a novel strategy for the development of production of cell cultured meat.

Reference:

GUO X, YANG F, QI Y, et al. Albumen/gelatin bio-inks preparation in 3D bio-printing for

in situ

翻譯： 王立磊（實習(xí)）

編輯：梁安琪；責(zé)任編輯：孫勇

封面圖片：圖蟲創(chuàng)意

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