中科院1區（8.3）-天麻素通過Keap1/Nrf2信號通路抑制肝鐵死亡改善非酒精性脂肪肝病

【寫在前面】：本期推薦的是由貴州醫科大學附屬醫院感染病科、 貴州醫科大學附屬醫院國家藥物臨床試驗機構、貴州醫科大學等研究團隊合作近期發表于Phytomedicine(IF8.3）的一篇文章，揭示天麻素通過Keap1/Nrf2信號通路抑制肝鐵死亡改善非酒精性脂肪肝病。

【期刊簡介】

【題目及作者信息】

Gastrodin ameliorates nonalcoholic fatty liver disease via inhibiting hepatic ferroptosis by the Keap1/Nrf2 signaling pathway

背景

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是一個全球性的健康挑戰，目前缺乏有效的治療方法。天麻素（GAS）是從天麻（蘭科）中提取的一種主要酚苷類化合物，具有多種有益特性，但其通過鐵死亡途徑在NAFLD中的潛在作用尚不清楚。

目的

研究GAS對NAFLD的治療效果，并闡明其潛在的分子機制。

方法

我們使用高脂飲食（HFD）喂養的小鼠以及用棕櫚酸（PA）和油酸（OA）處理的HepG2細胞建立了NAFLD模型。通過組織病理學和生化分析評估治療效果。采用免疫共沉淀（Co-IP）、藥物親和響應靶標穩定性（DARTS）、細胞熱位移分析（CETSA）和雙熒光素酶報告基因檢測等技術研究分子機制和藥物靶點。

結果

GAS治療顯著減輕了肝臟炎癥和脂質積聚，從而改善了代謝參數。此外，GAS減少了鐵過載和氧化應激標志物，恢復了抗氧化防御能力，并保護了線粒體功能。機制研究表明，相互作用實驗揭示GAS直接結合Keap1，破壞Keap1/Nrf2復合物，促進Nrf2核轉位，并增強下游靶基因FSP1和GPX4的表達。

結論

GAS通過直接靶向Keap1/Nrf2信號通路抑制肝細胞鐵死亡，顯示出作為NAFLD治療藥物的顯著潛力。

圖文摘要

【前言】

非酒精性脂肪性肝病是一種普遍的慢性肝臟疾病，目前影響著全球約三分之一的人口。高脂高果糖飲食攝入和接觸毒素等飲食習慣是脂肪肝發生的關鍵因素。該疾病以肝細胞內脂質過度積聚為特征，已成為慢性肝病的主要原因。隨著病情進展，它可能發展為非酒精性脂肪性肝炎、肝纖維化、肝硬化甚至肝細胞癌。目前它被歸類為一種多因素代謝性疾病，且尚無特異性治療方法。人們普遍認為，其發病機制涉及肝細胞內脂質異常積聚、肝臟脂毒性、氧化應激、脂質過氧化和促炎因子。該疾病的特征是肝細胞內脂質積聚以及脂質代謝相關基因表達失調，從而導致脂質過氧化和氧化應激。氧化應激、脂質過氧化和線粒體功能障礙是細胞死亡的關鍵驅動因素。據報道，氧化應激會引發隨后的肝臟損傷和肝細胞死亡，在該疾病的發病機制中起著關鍵作用。除了細胞凋亡和壞死，其他類型的細胞死亡也可能與其相關的肝毒性有關。

鐵死亡是一種鐵依賴性的調節性細胞死亡形式，其特征是鐵驅動的多不飽和脂肪酸過氧化，導致活性氧積累和隨后的細胞死亡。肝臟中的鐵沉積與該疾病的各種組織病理學特征相關，相當比例的患者表現出肝臟鐵過載，這會加重脂肪性肝炎。過度的鐵積聚可能增加肝細胞氣球樣變、炎性浸潤和纖維化進展，從而推動疾病向更嚴重的階段發展。研究表明，鐵死亡抑制劑可以減輕特定飲食誘導的脂肪性肝炎中的脂肪變性和炎癥。與谷胱甘肽過氧化物酶4一起，鐵死亡抑制蛋白1作為一種抗氧化調節劑，用于清除脂質過氧自由基并防止鐵死亡。鐵死亡抑制蛋白1是一種氧化還原酶，通過將輔酶Q10還原為泛醇來抑制鐵死亡，泛醇是一種親脂性自由基捕獲抗氧化劑，可抑制脂質過氧化。核因子紅細胞2相關因子2是細胞抗氧化反應通路的主要轉錄因子。在沒有外源應激的情況下，Kelch樣ECH關聯蛋白-1與該因子相互作用，促進其泛素化和蛋白酶體降解。當該關聯蛋白被修飾或與其他分子結合時，該因子與其分離，隨后得以穩定、積累并發生核轉位。該因子靶向鐵死亡抑制蛋白1的啟動子區域并影響其轉錄活性。研究表明，鐵死亡抑制蛋白1可調節非小細胞肺癌細胞中的鐵死亡。

天麻素是天麻根莖中的一種主要酚苷，具有抗凋亡、抗炎和抗氧化特性，并能調節脂質代謝。在藥物或化學物誘導的肝損傷動物模型中，該成分抑制了炎癥和氧化應激，并調節了腸道菌群組成。研究表明，該成分可以通過激活高脂高膽固醇飲食喂養小鼠體內的特定通路來改善脂肪肝。此外，該成分在接受高膽固醇飲食的模式生物中表現出抗氧化活性和降脂作用。然而，該成分對脂肪肝中肝細胞鐵死亡以及疾病向更嚴重階段進展的影響尚不清楚。該成分是一種潛在的鐵死亡抑制劑。在藥物誘導的腎毒性中，它通過介導特定信號軸抑制了腎小管上皮細胞的鐵死亡。另一項研究中，它通過減少神經遞質釋放、細胞凋亡或氧化應激來保護膠質瘤細胞免受鐵死亡的影響。目前尚無關于該成分是否能抑制肝細胞鐵死亡并改善脂肪肝的報道。近期研究表明，該成分可激活特定通路并促進關鍵因子的表達。然而，該成分是否通過該關鍵因子影響鐵死亡相關基因的表達尚未得到研究。

本研究證明，該成分通過抑制鐵死亡來減輕肝損傷并減少肝臟脂質積聚。從機制上講，它促進關鍵因子核轉位并增加下游靶基因的轉錄，從而抑制肝細胞鐵死亡并改善脂肪肝。這些發現表明，該成分是治療該疾病的一個有前景的候選藥物。

【結果部分】

1.天麻素改善了高脂飲食誘導的小鼠肝損傷和炎癥。

圖1. 天麻素（GAS）改善了高脂飲食（HFD）誘導的小鼠肝損傷和炎癥。(A) GAS的化學結構式。(B) 實驗時間線示意圖。(C) 代表性肝臟外觀照片及蘇木精-伊紅（H&E）染色圖（比例尺：5 mm和40 μm）。(D) 肝臟重量及肝體比。(E) 血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）和天冬氨酸氨基轉移酶（AST）水平。(F) 肝臟切片中CD68免疫熒光染色圖（比例尺：50 μm）。(G) 肝臟組織中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白介素-18（IL-18）的mRNA表達水平。

2.天麻素在體內外實驗中均減輕了肝臟脂肪變性。

圖2. 天麻素（GAS）減輕了高脂飲食（HFD）誘導的小鼠肝臟脂肪變性。(A)肝臟切片代表性油紅O染色圖（比例尺：40 μm）。(B) 血清甘油三酯（TG）和總膽固醇（TC）水平。(C) 肝臟組織中TG和TC含量。(D) 肝臟組織中固醇調節元件結合蛋白1c（Srebp-1c）、肉堿棕櫚酰轉移酶1a（Cpt1a）、酰基輔酶A氧化酶1（Acox1）、過氧化物酶體增殖物激活受體α（Ppara）及脂肪酸合酶（Fasn）的mRNA表達水平。(E) 蛋白質免疫印跡法檢測SREBP-1C、CPT1A、ACOX1、PPAR-α及脂肪酸合酶（FAS）的蛋白表達水平。(F) 肝臟組織中PPARα免疫熒光染色圖。(G) 葡萄糖耐量試驗（GTT）結果。(H) 血漿葡萄糖水平。

3.天麻素在體內外均能抑制鐵死亡。

圖3. 天麻素（GAS）在體內外抑制鐵死亡。(A)差異表達基因火山圖（天麻素處理組，GAS vs. 高脂飲食處理組，M）。(B) 差異基因的KEGG富集分析。(C) 肝臟丙二醛（MDA）水平。(D) 肝臟谷胱甘肽（GSH）水平。(E) HepG2細胞中BODIPY 581/591 C11熒光（脂質過氧化）染色（比例尺：20 μm）。(F) HepG2細胞中JC-1染色（線粒體膜電位）（比例尺：20 μm）。(G) HepG2細胞中DHE（二氫乙啶，活性氧）染色（比例尺：20 μm）。(H) HepG2細胞中FerroOrange（亞鐵離子）染色（比例尺：20 μm）。(I) HepG2細胞中線粒體的代表性電鏡圖像（比例尺：500 nm）。(J) HepG2細胞中轉鐵蛋白受體1（Tfr1）、谷胱甘肽過氧化物酶4（Gpx4）、鐵死亡抑制蛋白1（Fsp1）、長鏈脂酰輔酶A合成酶4（Acsl4）和前列腺素內過氧化物合酶2（Ptgs2）的mRNA表達。(K) HepG2細胞中GPX4、FSP1、轉鐵蛋白受體1（TFR1）、ACSL4和膜鐵轉運蛋白1（FPN1）的蛋白水平。(L) 小鼠肝臟GPX4免疫熒光染色（比例尺：20 μm）。

4.天麻素在體外通過抑制鐵死亡緩解非酒精性脂肪肝病。

圖4. 天麻素（GAS）在體外通過抑制鐵死亡緩解非酒精性脂肪肝病（NAFLD）。(A)HepG2細胞中丙二醛（MDA）水平。(B) HepG2細胞中谷胱甘肽（GSH）水平。(C) DHE（二氫乙啶）染色（比例尺：20 μm）。(D) FerroOrange（亞鐵離子）染色（比例尺：20 μm）。(E) BODIPY C11（脂質過氧化）熒光染色（比例尺：20 μm）。(F) JC-1（線粒體膜電位）染色（比例尺：20 μm）。(G) GPX4（谷胱甘肽過氧化物酶4）免疫熒光染色（比例尺：40 μm）。(H) HepG2細胞中油紅O染色（脂滴，比例尺：50 μm）。(I) SREBP1（固醇調節元件結合蛋白1）、CPT1A（肉堿棕櫚酰轉移酶1A）、ACOX1（酰基輔酶A氧化酶1）、PPAR-α（過氧化物酶體增殖物激活受體α）和FAS（脂肪酸合酶）的蛋白表達水平。(J) GPX4、FSP1（鐵死亡抑制蛋白1）、TFR1（轉鐵蛋白受體1）、ACSL4（長鏈脂酰輔酶A合成酶4）和FPN1（膜鐵轉運蛋白1）的蛋白表達水平。

5.天麻素促進Nrf2核轉位并增強FSP1和GPX4的轉錄表達。

圖5. 天麻素（GAS）促進Nrf2核轉位并增加FSP1和GPX4的轉錄。(A)小鼠肝臟中Nrf2（核因子E2相關因子2）和Keap1（Kelch樣ECH關聯蛋白1）的蛋白水平。(B) HepG2細胞中Nrf2和Keap1的蛋白水平。(C) 經PA+OA（棕櫚酸+油酸）和/或GAS/SFN（蘿卜硫素）處理的HepG2細胞中胞漿與細胞核Nrf2蛋白水平。(D) Nrf2免疫熒光染色（比例尺：5 μm）。(E) HepG2細胞中Fsp1和Gpx4的mRNA表達。(F) Nrf2峰頂富集的基序。(G) AIFM2（凋亡誘導因子線粒體關聯蛋白2）啟動子中ARE（抗氧化反應元件）結合位點示意圖。(H) AIFM2啟動子區域Nrf2結合峰的ChIP-seq（染色質免疫沉淀測序）結果（數據來源：GSE91809）。(I) Fsp1和Gpx4啟動子活性的熒光素酶報告基因檢測。

6.天麻素通過Keap1/Nrf2信號通路保護HepG2細胞免受鐵死亡影響。

圖6. 天麻素（GAS）通過Keap1/Nrf2信號通路保護HepG2細胞免受鐵死亡影響。(A)丙二醛（MDA）水平。(B) 谷胱甘肽（GSH）水平。(C) DHE（二氫乙啶）染色（比例尺：20 μm）。(D) FerroOrange（亞鐵離子）染色（比例尺：20 μm）。(E) JC-1（線粒體膜電位）染色（比例尺：20 μm）。(F) BODIPY C11（脂質過氧化）熒光染色（比例尺：10 μm）。(G) FSP1（鐵死亡抑制蛋白1）免疫熒光染色（比例尺：40 μm）。(H) SREBP1（固醇調節元件結合蛋白1）、CPT1A（肉堿棕櫚酰轉移酶1A）、ACOX1（酰基輔酶A氧化酶1）、PPAR-α（過氧化物酶體增殖物激活受體α）和FAS（脂肪酸合酶）的蛋白表達水平。(I) 油紅O染色（脂滴）（比例尺：50 μm）。(J) GPX4（谷胱甘肽過氧化物酶4）、FSP1、TFR1（轉鐵蛋白受體1）、ACSL4（長鏈脂酰輔酶A合成酶4）和PTGS2（前列腺素內過氧化物合酶2）的mRNA表達水平。(K) GPX4、FSP1、TFR1、ACSL4和FPN1（膜鐵轉運蛋白1）的蛋白表達水平。

7.天麻素直接靶向Keap1以降低其與Nrf2的結合。

圖7. 天麻素（GAS）直接靶向Keap1以減弱其與Nrf2的結合。(A)通過細胞熱位移分析檢測GAS處理下Keap1的熱穩定性。(B) 在48°C下，不同濃度GAS對Keap1穩定性的影響。(C) 在蛋白酶與蛋白比例為1:300的條件下，不同濃度GAS對Keap1穩定性的影響。(D) GAS與Keap1的分子相互作用示意圖，結合能為-6.8 kcal/mol。(E) GAS處理后，通過免疫共沉淀檢測Nrf2與Keap1的結合情況。

8.本研究的作用機制圖。

【結論與討論】

總之，我們的研究結果表明，天麻素（GAS）能夠通過Keap1/Nrf2信號軸減輕高脂飲食（HFD）誘導的非酒精性脂肪肝病（NAFLD）進展。 機制研究表明，GAS靶向Keap1，減少其與Nrf2的結合，并促進Nrf2的穩定與核轉位。研究發現，GAS處理后，Nrf2與下游抗氧化基因的啟動子結合，從而促進其轉錄并抑制鐵死亡。本研究首次通過實驗揭示，GAS通過靶向調節Keap1/Nrf2信號通路，改善了鐵死亡驅動的NAFLD（圖8）。 我們的發現為探索NAFLD的治療確立了一種新的治療策略和理論基礎。

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