EBF：全血穩定性研究在生物樣品分析方法學驗證中的建議更新（2025）

采用血漿/血清開展生物樣品分析方法學穩定性測試非常常見。不過，在生物樣品離心之前，樣本采集時的基質（全血）本質上與血漿/血清是不同的。也就是，血漿/血清只能代表離心后樣本，不能說明從人體/動物采集的血液在運輸、離心等前期環節中的穩定性情況。

歐洲生物分析論壇（EBF）2008年進行過一項調研，只有少數公司在常規進行小分子的方法驗證或方法開發時會包括全血穩定性，而對于大分子，幾乎沒有任何公司開展。據EBF成員反饋，與血漿/血清穩定性數據相矛盾的全血穩定性數據的發生率很低。言外之意，待測藥物在血漿/血清中穩定，在全血中應該也是穩定的。然而，其實自2001年以來，FDA關于生物分析方法驗證的監管指導（Guidance for Industry-Bioanalytical Method Validation）就指出“穩定性程序應評估在樣本采集和處理過程中分析物的穩定性”。EMA在相關指南（Draft Guideline on Validation of Bioanalytical Methods）中也提到“應充分關注采血后樣本基質中分析物的穩定性”。

中國藥典2020版《生物樣品定量分析方法驗證指導原則》中指出，應特別關注受試者采血時，以及在儲存前預處理的基質中分析物的穩定性，以確保由分析方法獲得的濃度反映受試者采樣時刻的分析物濃度。ICH M10也建議進行全血穩定性測試，即樣品從受試者采集之后到儲存之前，應該充分關注樣品基質（全血）中待測物的穩定性。

開展全血穩定性的挑戰之一，許多生物分析專家認為血漿穩定性是血液穩定性的可接受替代品，例外情況非常罕見，僅限于某些已知的化合物類別，如N-氧化物或羥肟酸。不過，有證據表明血漿穩定性可能不是血液穩定性的良好指標。血液和血漿穩定性不匹配的情況占5%左右。挑戰之二來自新鮮空白血液的可用性問題。另外，分析物在血細胞和血漿之間達到分布平衡的時間未知。還有一點，是否應像處理血漿/血清數據那樣對全血分析方法進行驗證，或者是否需要額外的準確度和精密度數據來證明在全血中進行的測量與在血漿中進行的測量同樣可靠。

自2008年以來，EBF內部進行了密集的討論，努力對作為血漿/血清方法開發和驗證一部分的藥物全血穩定性測試的時機、流程、問題等達成一致。從時間角度，最初只有少數公司參與這些實驗，但隨著時間的推移，EBF成員公司逐漸增加了對血液穩定性的常規測試。從科學角度而言，確保樣本中的分析物濃度從采集點到生成血漿/血清基質的樣品過程中得以保持，全血穩定性評估至關重要。

EBF在2011年首次發布了關于全血穩定性測試的建議，并在2025年做了進一步更新，以下是具體介紹。

關于新鮮血液的供應：盡管生物分析人員在確保新鮮血液供應方面存在困難，但EBF內部調查顯示，對于許多公司來說，這似乎并不是一個主要障礙。然而，關于“新鮮”血液的定義以及在實驗進行時血液應該有多新鮮是一個核心問題。2011年，EBF絕大多數觀點認為，如果在采集后的24小時內使用，并且使用與血漿分析中相同的抗凝劑，則血液可以被視為新鮮的。當然，血液不應被冷凍。即使在冷藏或冰上保存，也不應超過建議的時間。建議在添加樣品前將血液預熱至37℃，以模擬生理條件。不過，2011年這版建議對于EBF社區的許多成員來說執行起來極為困難，尤其是對于臨床前血液，因為這些血液需要購買并運輸到生物分析現場。此外，對于24小時的時間限制也沒有科學依據。2025年更新后的建議是，如果血液在采集后5天內冷藏并使用，則可以被視為新鮮的。

實驗操作細節：2011年，EBF許多專家建議向血液中添加測試化合物（體外添加）的血液樣本進行穩定性測試，然后將這些樣本離心以收集血漿，進而使用現有的經過驗證的血漿分析方法來分析這些血漿樣本。當然，如前文所述，在將測試化合物添加到血液中時，血液應被加熱至37℃。分析全血穩定性樣本的實驗過程可能是通過添加乙腈或類似溶劑來沉淀蛋白質，這些溶劑最好含有內標。在收集了所有穩定性時間點的樣本后，可以測量上清液，并將結果與零時間點獲得的參考值進行比較。2025年，更新后的建議是在全血中比較穩定性時間點與零時間點的峰面積比。

體外平衡時間的確定：盡管平衡通常很快，但并非瞬間完成。在EBF內部討論中，認為有些化合物需要孵化15分鐘或更長時間才能達到平衡。雖然這樣的例子可能很罕見，但應明確強調，作為實驗設計的一部分，建議估計必要的孵化時間。

濃度水平、重復次數和接受標準：對于存在爭議的其他主題，如測試多少濃度水平、進行多少重復以及生成的數據的接受標準是什么。EBF認為，血液穩定性測試的接受標準應與血漿穩定性測試中應用的標準相同。

種屬：2011年，EBF建議全血穩定性實驗將首先在一個種屬中進行，只有在觀察到不穩定性時，才會擴展到其他種屬。2025年EBF更新后的建議是，全血穩定性測試可以在人血中進行，并且只有在人血中觀察到不穩定性，或者在臨床前血漿中觀察到不穩定性的情況下，才擴展到臨床前全血。這種方法在很大程度上克服了行業在獲取新鮮臨床前血液方面的挑戰，并考慮了3R原則，即只有在絕對必要時才使用臨床前全血。EBF經驗表明，人類全血穩定性數據在監管申報中是可以接受的，以支持臨床前數據。

當然，全血穩定性實驗主要針對小分子分析用的色譜法。對于生物藥常用的配體結合方法不適用。

引自：2025, Whole blood stability in bioanalytical method validation: updated recommendations from the European Bioanalysis Forum；2011, Blood Stability Testing: European Bioanalysis Forum View on Current Challenges for Regulated Bioanalysis

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