安全藥理學(xué)研究伴隨一般毒理試驗開展的可行性、挑戰(zhàn)、具體評價方法及181個案例

將安全藥理學(xué)終點納入重復(fù)給藥毒理研究中符合動物“3R”原則，也節(jié)約研究成本。那么這種合并研究需要注意哪些細(xì)節(jié)呢？圍繞這個話題略作討論。

重復(fù)給藥毒理研究中納入安全藥理學(xué)終點可以從科學(xué)和法規(guī)兩個層面分析。

首先是科學(xué)層面。早在20世紀(jì)70年代末，由Gerhard Zbinden領(lǐng)導(dǎo)的毒理學(xué)先驅(qū)們就開始呼吁在毒性研究中納入安全藥理學(xué)終點，隨后這一觀點得到了業(yè)內(nèi)同行的呼應(yīng)。將安全藥理學(xué)終點納入重復(fù)給藥毒性研究的科學(xué)依據(jù)主要基于以下幾點：

1）延遲效應(yīng)現(xiàn)象：單獨的安全藥理學(xué)研究通常為單次給藥。如果僅評估單次給藥的效應(yīng)，可能會遺漏延遲出現(xiàn)的效應(yīng)。例如胺碘酮對QT間期的延遲性、進(jìn)行性影響，通常在心肌中積累數(shù)天甚至數(shù)周后才顯現(xiàn)。又如用于治療冠心病、糖尿病、肥胖癥、關(guān)節(jié)炎、注意力缺陷多動障礙和精神障礙的藥物可能會增加心血管不良事件的發(fā)生率或心血管風(fēng)險因素。這些風(fēng)險通常是在長期治療后才顯現(xiàn)的。

2）功能變化與病理變化的關(guān)系：一些功能變化可能先于病理損傷出現(xiàn)，或者在較低暴露水平下發(fā)生，因此可以作為臨床可轉(zhuǎn)化的生物標(biāo)志物，用于指導(dǎo)和限制臨床試驗中的劑量遞增。另外，一些病理變化是功能變化的結(jié)果，如由于藥物誘導(dǎo)的持續(xù)心動過速和/或低血壓，導(dǎo)致犬和猴出現(xiàn)特定的心臟病變。合并研究可以在同一個體系中考察功能變化和病理變化的關(guān)系。

再看下法規(guī)層面。

1）1997年ICH S6關(guān)于生物制品的臨床前安全性評價指南頒布，指出安全藥理學(xué)試驗用于檢測潛在毒性的功能性指標(biāo)，這些功能性指標(biāo)可以通過單獨的試驗也可以結(jié)合在毒性試驗中考察。

2）FDA關(guān)于探索性新藥IND研究的指南也鼓勵將安全藥理學(xué)終點納入毒性研究（Guidance for Industry, Investigators, and Reviewers Exploratory IND Studies,2006），從而減少了單獨開展安全性藥理學(xué)研究的必要性。

3）2009年修訂后的ICH指導(dǎo)文件（S9）關(guān)于腫瘤藥物非臨床評價的指南也基本取消了對單獨安全性藥理學(xué)研究的法規(guī)要求，心血管、呼吸和中樞神經(jīng)系統(tǒng)這些參數(shù)可納入到一般毒理學(xué)試驗中。在非嚙齒類動物中進(jìn)行了給藥后的詳細(xì)臨床癥狀觀察及合適的心電圖檢查，通常認(rèn)為已經(jīng)足夠。

4）此外，某些專門的法規(guī)要求還包括納入特定的行為測量，如ICH S5(R2): detection of toxicity to reproduction for medicinal products and toxicity to male fertility和Guideline on the need for non-clinical testing in juvenile animals of pharmaceuticals for paediatric indication(EMA, 2008)。這些出生后發(fā)育的法規(guī)指南要求對在妊娠期間暴露于受試物的F1代進(jìn)行行為測試，以及幼齡動物毒理研究中，對新生和/或幼年動物進(jìn)行給藥，需使用行為測試進(jìn)行評估。行為測試包括功能性觀察組合（FOB）、運動活動、運動協(xié)調(diào)（例如旋轉(zhuǎn)桿）和學(xué)習(xí)與記憶測試。因此，如果以上行為學(xué)評估可以納入這些專門的研究中，那么原則上也可以將其納入一般毒理研究中。

安全藥理終點納入一般毒理研究面臨的挑戰(zhàn)

雖然無論科學(xué)層面還是法規(guī)層面，都有將安全藥理學(xué)終點納入一般毒理研究的支持性證據(jù)。但這一合并研究也存在一些客觀挑戰(zhàn)。

重復(fù)給藥毒性研究的目的是讓動物在較長時間內(nèi)暴露于不同劑量的受試物，評估全身毒性指標(biāo)，并最終在尸檢后評估組織病理學(xué)變化。任何額外的安全藥理學(xué)測量都不應(yīng)且不能干擾這些目標(biāo)。然而，研究設(shè)計、實驗室設(shè)計和環(huán)境可能并不適合獲取高質(zhì)量的安全藥理學(xué)數(shù)據(jù)。下圖中，圖1a是為安全藥理學(xué)研究專門設(shè)計的嚙齒動物實驗室，圖1b則是典型的嚙齒動物毒理研究飼養(yǎng)室（及準(zhǔn)備室），黃色區(qū)域是進(jìn)行功能測試的場所，比較直觀展現(xiàn)了實驗室設(shè)計差異可能引入的挑戰(zhàn)。

將安全藥理學(xué)評估整合到一般毒理研究中需要一定的妥協(xié)和調(diào)整。例如，根據(jù)研究類型和功能測量的需求，可能需要錯開開始日期，例如連續(xù)兩天分散進(jìn)行，以便對主研究組的所有動物進(jìn)行測量，或者在安全藥理學(xué)評估當(dāng)天錯開給藥時間，以便在藥物濃度達(dá)到最大值（Tmax）的時間點進(jìn)行測量。

還有一個挑戰(zhàn)來自重復(fù)給藥的藥物耐受性。重復(fù)給藥毒性研究的第一天通常是工作人員最繁忙的一天；當(dāng)天已經(jīng)安排了在特定時間點進(jìn)行TK采樣，而且操作室相對擁擠，有參與毒性研究的技術(shù)人員、課題負(fù)責(zé)人、質(zhì)量保證人員甚至委托方人員。其實并不是一個適合安靜且仔細(xì)測量生理和行為參數(shù)的時間點。但如果選擇在第2天進(jìn)行測量，可能會錯過首次給藥的峰值效應(yīng)，而這一效應(yīng)可能在第二次給藥時已經(jīng)減弱或完全改變。但如果第1天受試物出現(xiàn)一定程度的不良反應(yīng)，就不得不在第2天進(jìn)行安全藥理數(shù)據(jù)收集，算是一種權(quán)衡。所以，一般安全性比較好的候選藥物，比如某些單抗或者多肽，比較適合安全藥理伴隨一般毒理開展。這里要注意下，如果不單獨開展安全藥理研究，而是將其并入重復(fù)給藥毒理，屬于后者替代前者。對于這種情況，藥物耐受性的挑戰(zhàn)是要重視的，需最大可能保障安全藥理數(shù)據(jù)的高質(zhì)量獲取。但如果單獨開展安全藥理研究，同時重復(fù)給藥加設(shè)安全藥理終點，屬于后者是前者的補充，要求就靈活很多，不太需要對毒理設(shè)計進(jìn)行太多調(diào)整。

除了以上，安全藥理學(xué)研究和一般毒理研究在細(xì)節(jié)方面還有很多區(qū)別，如下表所示。

合適的安全藥理評價方法

在重復(fù)給藥毒性研究中用于評估安全藥理學(xué)終點，除了來自研究設(shè)計、實驗室設(shè)計和環(huán)境的挑戰(zhàn)，安全藥理參數(shù)收集的方法也很關(guān)鍵，理想情況下應(yīng)是非侵入性的、不會引起應(yīng)激、不需要麻醉且不需要限制進(jìn)食。否則，應(yīng)考慮設(shè)置衛(wèi)星組，甚至單獨開展研究。設(shè)備需要便于攜帶且相對小巧：理想情況下，應(yīng)將設(shè)備移動到動物飼養(yǎng)處，而不是將動物轉(zhuǎn)移到設(shè)備處。或者，設(shè)備可以是設(shè)施的一部分，并專門用于測量（如非侵入性遙測接收器）。測量應(yīng)由熟悉如何獲取高質(zhì)量安全藥理學(xué)數(shù)據(jù)的科學(xué)家和技術(shù)人員進(jìn)行，并且他們應(yīng)具備收集、分析和解釋數(shù)據(jù)的能力。下表列出了適用于重復(fù)給藥毒性研究主試驗動物的安全藥理相關(guān)指標(biāo)收集方法示例，主要包括心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)。

特定器官功能的應(yīng)用

安全性藥理學(xué)評估的五個器官功能包括心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、胃腸道系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)。除此之外，有時還會增加全身代謝功能的評估。

心血管系統(tǒng)

ECG間期和形態(tài)

近年來，市場上出現(xiàn)了適用于犬和非人靈長類動物的馬夾式的非侵入式、便攜式遙測系統(tǒng)。這些系統(tǒng)能夠在動物的自然環(huán)境中，對清醒或睡眠狀態(tài)下的自由活動動物進(jìn)行至少24小時的連續(xù)II導(dǎo)聯(lián)心電圖記錄。這種遙測系統(tǒng)獲得的數(shù)據(jù)質(zhì)量優(yōu)于傳統(tǒng)“快照式”記錄方法獲得的數(shù)據(jù)質(zhì)量，包括實現(xiàn)更低的靜息心率，并且數(shù)據(jù)量更多。這種方法能夠確定效應(yīng)的起始時間、持續(xù)時間、強度和可逆性，以及劑量依賴性和PK-PD關(guān)系。將QT間期與RR間期作圖可以避免QT校正因子帶來的不準(zhǔn)確問題，并能揭示藥物在不同心率水平下的誘導(dǎo)變化。

與檢測QT間期效應(yīng)不同，在自然發(fā)生的心率升高期間進(jìn)行采樣有助于檢測鈉通道阻斷劑引起的QRS間期延長。與hERG鉀通道阻斷不同，鈉通道阻斷是心率依賴的。與快照式心電圖相比，24小時采樣期間檢測到心律失常的可能性更大，同時也能檢測到研究前已存在的波形異常。另外，與植入式遙測設(shè)備的單次給藥安全藥理學(xué)研究相結(jié)合時，非侵入式心電圖測量有時可以揭示在重復(fù)給藥時加劇的效應(yīng)。

左心室功能

在未麻醉的犬中使用超聲心動圖是一種成熟的技術(shù)。可以通過超聲心動圖在未經(jīng)鎮(zhèn)靜、預(yù)先訓(xùn)練、綁定（或側(cè)臥位）的犬以及小型豬中監(jiān)測左心室功能。超聲心動圖也可以用于食蟹猴，但需要鎮(zhèn)靜或麻醉。在比格犬中，通過超聲心動圖得出的左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）與通過植入式遙測設(shè)備在同一批動物中測量的左心室最大壓力變化率（dP/dtmax）之間觀察到良好的一致性。此外，QA間期（心電圖的Q波與主動脈壓力波上升的時間間隔）也可以用作心室收縮力的指標(biāo)。

動脈血壓

在嚙齒類動物中，非侵入性血壓測量方法采用尾袖法。然而，這種方法只能可靠測量收縮壓和心率，并且需要預(yù)熱和約束才能獲得測量值。即使在研究前適應(yīng)了這些記錄條件，所獲得的收縮壓和心率值仍高于未約束且植入遙測設(shè)備的動物。鑒于法規(guī)要求重復(fù)給藥毒性研究在兩種動物中進(jìn)行，在較大的非嚙齒動物中進(jìn)行心血管評估更為合理。尾袖血壓測量法本身在犬中也有很好的應(yīng)用，而最近引入的高分辨率振蕩法（HDO）能夠捕捉血壓波形，并準(zhǔn)確測量收縮壓、舒張壓和平均動脈壓。HDO也已用于食蟹猴。

對于犬，有可供使用的便攜式尾袖法，結(jié)合非侵入性遙測技術(shù)在同一動物中同時測量心電圖和血壓。另一種方法是通過連接到微型遙測發(fā)射器的動脈導(dǎo)管，在犬或食蟹猴中進(jìn)行最小侵入性血壓測量。

神經(jīng)系統(tǒng)

全面神經(jīng)行為學(xué)評估

由于神經(jīng)系統(tǒng)功能的極端多樣性和復(fù)雜性，無法設(shè)計出一種方便的體內(nèi)評估方法來涵蓋所有功能。因此，在安全性藥理學(xué)中，首先使用的是神經(jīng)行為學(xué)評估，形式可以是功能性觀察組合（FOB）或Irwin試驗。

自動化活動分析

嚙齒類動物的活動可以通過兩種方式評估：籠內(nèi)活動或在新環(huán)境中活動（自發(fā)運動活動）。這兩種測量方法有很大不同。后者涉及探索動機與在不熟悉環(huán)境中焦慮增加之間的沖突。可以使用光柵陣列或視頻跟蹤來監(jiān)測。在新環(huán)境中，動物的活動和直立行為最初很高，隨著動物探索和適應(yīng)環(huán)境，大約30分鐘后逐漸減弱，最終大部分時間處于靜止或梳理毛發(fā)狀態(tài)。籠內(nèi)活動則沒有沖突或適應(yīng)性成分。

目前，正在出現(xiàn)一種新技術(shù)，用于在群居飼養(yǎng)的嚙齒動物的籠內(nèi)測量個體的活動、行為和體溫，而無需外科植入遙測發(fā)射器。可以使用植入皮下的射頻識別微芯片應(yīng)答器（“RFID芯片”）通過放置在籠子下方的基板閱讀器檢測，來測量群居飼養(yǎng)嚙齒動物的籠內(nèi)活動；這種方法還可以結(jié)合測量活動和體溫。同樣，也可以通過這種方式監(jiān)測群居飼養(yǎng)嚙齒動物的個體食物和水分?jǐn)z入量。

犬和猴的活動可以通過在它們項圈中的加速度計或作為非侵入性遙測系統(tǒng)的一部分來測量。使用不同顏色的外套可以實現(xiàn)對群居飼養(yǎng)的食蟹猴進(jìn)行定量視頻跟蹤。

其它神經(jīng)行為系統(tǒng)指標(biāo)還包括視覺功能、瞳孔、唾液分泌、肌肉功能等，在上表中已作介紹。

呼吸系統(tǒng)

可以從嚙齒動物（通常是大鼠）中輕松獲取呼吸參數(shù)，使用全身描記術(shù)是一種非侵入性、無需約束的方法，通過測量因吸氣和呼氣導(dǎo)致的腔室壓力變化來實現(xiàn)。使用全身描記術(shù)的獨立安全藥理學(xué)研究通常在給藥前需要60-90分鐘的穩(wěn)定期，以確保穩(wěn)定的呼吸信號，并減少因活動、嗅探、梳理毛發(fā)或直立行為導(dǎo)致的信號干擾。給藥后記錄通常持續(xù)長達(dá)6小時。該技術(shù)必須采用適當(dāng)?shù)臏囟群蜐穸妊a償，以確保準(zhǔn)確測定潮氣量。將這種技術(shù)應(yīng)用于重復(fù)給藥毒理研究是可行的。

可以使用非約束、帶馬夾的遙測方法在犬中測量呼吸參數(shù)。這種技術(shù)稱為呼吸感應(yīng)描記術(shù)，涉及在胸腔和腹部放置柔性帶，能夠連續(xù)測量長達(dá)24小時的呼吸參數(shù)。這種非侵入性遙測技術(shù)還可以同時測量心血管參數(shù)，并且同樣可以用于非人靈長類動物。

其它如胃腸道系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、代謝功能等，用的較少，后續(xù)有機會再分享吧。

案例分享一（144款、單抗、多抗、ADC）

筆者回顧性分析了已上市的144款單抗、多抗及ADC類藥物，一起看下這些產(chǎn)品在實際申報過程中，安全藥理學(xué)研究是單獨開展還是伴隨一般毒理開展，還是單獨+伴隨組合的形式。

144款藥物中，單抗、雙抗、ADC的數(shù)量分別是118、16和10款。

118款單抗中，78款藥物的安全藥理學(xué)研究伴隨一般毒理研究開展，12款單獨開展，5款藥物是單獨+伴隨一般毒理相組合的形式，即部分試驗單獨開展如神經(jīng)系統(tǒng)安全藥理，部分安全藥理終點則伴隨在一般毒理研究中。這其中，還有21款藥物未開展安全藥理學(xué)研究。未開展安全藥理研究的多是生物類似藥，占15款。其它不開展安全藥理學(xué)研究的原因主要是沒有合適的相關(guān)動物種屬，如Daratumumab、Elotuzumab、Spesolimab。

16款雙抗中，13款安全藥理學(xué)研究伴隨一般毒理研究進(jìn)行，2款選擇了單獨開展，1款未開展。未開展安全藥理學(xué)研究的這款雙抗是Tebentafusp，這款蛋白不與動物靶點結(jié)合，所以非臨床毒理研究僅開展的體外評價（Tebentafusp can only recognize human HLA; therefore, all nonclinical toxicology studies were conducted in vitro. Therefore, no specific safety pharmacology studies were conducted）。

10款A(yù)DC藥物，6款選擇伴隨重復(fù)給藥毒理研究開展，4款單獨開展了安全藥理學(xué)研究。當(dāng)然，hERG試驗屬于體外研究，不計入內(nèi)。

所以，很明顯，大部分生物藥物安全藥理學(xué)研究是以伴隨一般毒理研究開展的形式為主，而且是心血管、呼吸系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的終點均納入一般毒理試驗中考察。

案例分享二（37款化藥）

以2023年FDA批準(zhǔn)上市的37款新分子實體藥物作為案例，分析下化藥安全藥理研究通常單獨開展還是伴隨一般毒理研究試驗開展。如下表所示，羅列了產(chǎn)品的商品名、通用名、獲批上市時間、開展形式和研究內(nèi)容示例。

37款化藥中，25款選擇了單獨開展的形式。6款采用的單獨開展和伴隨開展相結(jié)合的形式，其中2款選擇大鼠CNS和呼吸伴隨大鼠重復(fù)給藥毒理開展，2款僅大鼠呼系統(tǒng)安全藥理伴隨一般毒理開展。

3款則選擇全部安全藥理研究終點伴隨一般毒理試驗開展。QALSODY采用所有安全藥理研究終點伴隨一般毒理試驗開展，可能原因與本品為鞘內(nèi)注射，治療SOD1 基因突變的漸凍癥這一罕見病有關(guān)。MIEBO則僅在大鼠MTD中伴隨了CNS研究，未開展其它安全藥理學(xué)研究，可能與本品為滴眼液，系統(tǒng)暴露有限，或可能其它劑型考察過安全藥理終點，感興趣的可以進(jìn)一步求證。AUGTYRO心血管安全藥理研究伴隨食蟹猴一般毒理，可能與本品為抗腫瘤藥，適用ICH S9有關(guān)。

POSLUMA未開展安全藥理學(xué)研究，因本品為微劑量放射性物質(zhì)。

總而言之，大部分化藥還是以安全藥理研究單獨開展的形式進(jìn)行。再不濟也是以單獨開展為主，伴隨開展為輔，把相對沒那么重要的呼吸系統(tǒng)安全藥理研究摘出去，放到一般毒理試驗中。

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