疫苗佐劑究竟是如何發揮作用的？

疫苗是公共衛生領域最有效的干預措施之一，在減輕傳染病導致的發病和死亡方面發揮重要作用。這點在新冠大流行中相信很多人都印象深刻。疫苗必須具備兩個功能：1）提供作為免疫反應靶點的抗原；2）提供能夠引導免疫系統對靶抗原產生適當反應的免疫刺激信號。對于很多疫苗來說，免疫刺激信號來自一種額外添加的成分，稱為佐劑。佐劑在蛋白質和多糖抗原基礎的亞單位疫苗的開發中發揮了特別關鍵的作用，因為這些疫苗單獨使用時通常免疫原性很差。

疫苗佐劑對免疫反應影響是多方面的，可以促進B細胞親和力成熟，改變體液反應的廣度，增強抗體產生或記憶T細胞和B細胞反應的持久性，并控制記憶T細胞和B細胞反應的規模和表型。佐劑還可能對先天免疫產生長期影響。

關于佐劑增強疫苗的免疫反應這點已經得到充分驗證，但佐劑通過何種機制實現的影響往往知之甚少。

佐劑在成分組成上多種多樣，作用機制也不相同。最早臨床使用的佐劑是基于鋁懸浮液和油包水乳劑，之后出現了一些新型佐劑如Toll樣受體（TLRs）。新冠期間，通過脂質納米顆粒（LNPs）遞送的mRNA疫苗大放異彩。本文就佐劑的分類、作用機制等進行總結。

佐劑分類

簡單將佐劑類型分為下圖中的幾類，并逐一介紹。

第一類佐劑是作為抗原儲存庫以實現抗原的持續釋放。這些佐劑通常是生物材料，它們可以包裹或吸附添加的抗原，然后在注射后緩慢釋放抗原。最古老的疫苗佐劑是明礬（這是一個化學上的誤稱，用來指代鋁鹽、磷酸鋁或氫氧化鋁佐劑）。最初人們認為明礬主要作為抗原儲存庫發揮作用，但有幾項研究表明，這并非適用于所有抗原。此外，明礬還可以通過在注射部位引起局部細胞死亡來誘導炎癥，從而促進抗原的攝取和運輸到引流淋巴結。其他抗原儲存庫佐劑還包括陽離子脂質體（例如CAF01）、可生物降解的聚合物顆粒和可注射水凝膠。

第二類佐劑是在明礬之后廣泛應用于臨床的佐劑，基于油包水或水包油的乳劑，包括臨床配方如MF59和AS03。這些佐劑通常對抗原遞送沒有儲存庫效應，也沒有作用于特定的免疫學途徑，但它們能夠被注射部位的細胞攝取，從而激活炎癥體和細胞死亡途徑。這種局部炎癥反應有助于促進抗原的攝取和運輸到引流淋巴結，從而增強免疫反應。然而，炎癥體激活和細胞死亡途徑并非乳劑佐劑發揮作用的必要條件，或者可能只影響免疫反應的某些方面，說明這些佐劑的潛在機制是復雜的。

皂甙構成了第三類佐劑。皂甙是從智利皂樹（Quillaja saponaria）中首次分離出來的天然產物，屬于糖脂類萜烯。這些化合物具有類似表面活性劑的特性，能夠與細胞膜相互作用。盡管目前尚未發現它們作用的特定受體，但已證實它們可以誘導細胞產生應激反應和炎癥體激活，從而促進免疫反應。然而，與乳劑佐劑類似，到目前為止發現的皂甙的作用機制只能部分解釋它們的佐劑活性。盡管單獨的皂甙由于毒性過大而不適合廣泛用于人類疫苗，但將皂甙與膽固醇復合可以降低其毒性，同時保持其作為疫苗佐劑的效力。幾種皂甙配方已經經過了廣泛的臨床測試，佐劑AS01b（脂質體皂甙和單磷酸脂質A）和Matrix M（皂甙/磷脂納米顆粒）已被用于幾種已獲上市許可的疫苗中。

近年來，人們投入了大量精力開發針對特定生物受體的先天免疫刺激化合物作為佐劑，特別是那些識別與病原體入侵或組織損傷相關的分子模式的“危險信號”傳感器。例如，包括TLR激動劑、凝集素受體激動劑以及激活細胞內危險信號傳感器（如視黃酸誘導基因I（RIG-I）或干擾素基因刺激因子（STING））的化合物。

許多“危險信號”和皂甙佐劑是小分子化合物，其藥代動力學特性不利于作為疫苗的安全有效使用。因此，將這些化合物成功應用于疫苗的一個重要方法是將它們配制成脂質體或油包水納米乳劑（例如，AS01b中將TLR4激動劑單磷酸脂質A納入脂質體），或者吸附到明礬上（例如，AS37中將苯并萘啶類TLR7激動劑吸附到明礬上）。這種組合佐劑可能具有協同促進免疫的作用。

佐劑作用機制

疫苗佐劑的作用通常始于注射部位，如下圖所示。

調節免疫細胞募集和延長注射部位抗原作用時間

大多數疫苗出于方便、安全和耐受性考慮選擇肌肉注射給藥。大多數佐劑會刺激局部先天免疫細胞或基質細胞釋放炎癥細胞因子（如TNF-α、IL-1、IL-6和I型干擾素）和趨化因子（如CCL2、CCL4、CCL5和CXCL8）。傳統佐劑如鋁佐劑和油包水乳劑通過誘導局部細胞死亡和損傷相關分子模式（DAMPs）的釋放來實現這種局部刺激，而更具針對性的分子佐劑（如Toll樣受體激動劑）則通過其在組織中表達或被募集到疫苗注射部位的先天免疫受體發揮作用。這些趨化因子和局部炎癥會迅速在24小時內將中性粒細胞、單核細胞和髓系樹突狀細胞（DCs）募集到注射部位，并促進抗原遞呈細胞（APCs）的激活。重要的是，肌肉和/或引流淋巴結中的局部炎癥可以在不引起人類不適的情況下實現這些效果。因此，避免全身分布是佐劑設計的既定策略。

除了局部炎癥/免疫細胞募集方面的作用，佐劑還可以減緩抗原在注射部位的清除，為抗原在淋巴中的運輸以及注射部位和引流淋巴結中細胞的攝取提供更長的時間窗口。這種效應對抗原初次免疫反應尤其重要。其實，最初將鋁佐劑作為佐劑開發的主要原因就是一些抗原可以強烈吸附在鋁佐劑上，從而在免疫后實現更大的持久性。

延長疫苗可用性對下游免疫反應有多種影響。在免疫后，生發中心（GCs）在幾天內啟動，活化的B細胞開始增殖周期和體細胞超突變，以親和力成熟其抗原受體。如果在免疫后7到14天，當生發中心反應中首次產生親和力成熟的抗體時，抗原仍在到達引流淋巴結，那么到達的抗原可以被捕獲在濾泡樹突狀細胞上的免疫復合物中，這些細胞是濾泡中的特殊基質細胞，可以在數周甚至更長時間內在其表面展示抗原。這些細胞因此可以作為抗原庫，以驅動生發中心反應。在小鼠中，延長疫苗可用性已被證明可以增強生發中心和T濾泡輔助細胞（TFH）反應，增加抗體滴度，并增加體液反應的廣度。在非人靈長類動物（NHPs）中，初次免疫期間延長抗原作用時間證明可以增加生發中心反應的克隆性，募集極其罕見的B細胞前體參與免疫反應，并啟動可以持續至少6個月的生發中心。因此，開發能夠實現這些動力學效應的人疫苗佐劑/遞送系統頗為重要。

調節抗原在淋巴器官的轉運和蓄積

佐劑的一個關鍵作用機制是促進抗原運輸到淋巴器官，從而增加抗原在引流淋巴結（dLN）中的可獲得性。這種可獲得性的增強可以影響后續的免疫反應，包括抗原特異性淋巴細胞的擴增、淋巴細胞的分化以及B細胞在GCs中的親和力成熟。如上所述，佐劑（如明礬、油包水乳劑和Toll樣受體激動劑）通過誘導細胞因子和趨化因子來刺激注射部位的免疫細胞募集和抗原攝取，隨后通過細胞介導的方式將抗原運輸到引流淋巴結。這種細胞介導的抗原運輸在注射后數小時內開始，并在約24到48小時達到峰值，且可能會持續超過一周。

佐劑還可以直接調節募集到注射部位的APCs遷移到引流淋巴結的效率。例如，被脂多糖和某些氧化磷脂刺激的DCs會進入一種“高活性”狀態，伴隨著與細胞遷移和趨化相關的基因表達增加、運動能力增強以及從外周組織向淋巴結的遷移增加。

除了促進細胞介導的抗原運輸外，佐劑還可以直接影響淋巴中的抗原運輸，即非細胞依賴的抗原運輸。納米顆粒能夠有效地通過淋巴從組織中運輸，因此納米顆粒佐劑可以用于促進抗原在淋巴中的攝取和運輸。例如，基于聚合物或表面活性劑穩定的氫氧化鋁納米晶體的鋁佐劑可以在淋巴中運輸，而不是停留在注射部位，從而將吸附的抗原攜帶到引流淋巴結。

對于黏膜免疫的場景，抗原和佐劑被應用于鼻黏膜等上皮屏障時，如突變型霍亂毒素和殼聚糖等佐劑可以直接促進抗原跨黏膜屏障的攝取，從而允許抗原通過淋巴引流到達次級淋巴器官，它們通過短暫破壞上皮細胞間連接和/或改變細胞旁路運輸來實現這一過程。

抗原進入淋巴的量增加，并不能保證適應性免疫反應的增強，除非這些抗原能夠在下游的dLN中被捕獲。佐劑可以通過調節抗原從淋巴竇進入淋巴結實質，或者通過促進抗原被淋巴結駐留細胞捕獲，來促進這一過程。淋巴結的竇腔由淋巴內皮細胞和巨噬細胞襯里，竇巨噬細胞被認為在捕獲和轉移抗原（以病毒顆粒或免疫復合物的形式）進入淋巴結中發揮重要作用。油包水佐劑已被證明可以促進抗原在竇巨噬細胞和濾泡DCs的細胞內隔室中留存，作為抗原儲存庫，以維持免疫反應。然而，包括油包水乳劑、Toll樣受體激動劑和皂甙在內的多種類別的佐劑，也被證明會迅速引發竇襯巨噬細胞的消失（可能是死亡），這與淋巴結中抗原累積增加有關。竇襯巨噬細胞層的破壞并非合成疫苗佐劑的獨特特征，在活病毒和細菌感染期間也會發生。

佐劑還可以影響進入引流淋巴結的抗原的捕獲。免疫復合物和被補體修飾的抗原被具有補體受體的B細胞捕獲，并轉移給濾泡樹突狀細胞，從而在B細胞濾泡中實現抗原的長期保留。因此，能夠持續釋放抗原1到2周的緩釋生物材料佐劑，可能通過在新形成的免疫復合物中捕獲抗原，促進抗原傳遞給濾泡樹突狀細胞。

另外，考慮到增強抗原運輸、增加抗原進入淋巴結和在引流淋巴結中捕獲的加強，三種機制之間是互補的，作用于這些不同途徑的聯合佐劑可能會具有協同作用。

先天免疫激活和免疫細胞募集到淋巴結

如上所述，佐劑在注射部位發揮重要作用，但它們對dLN的下游效應同樣至關重要。注射后，各種佐劑迅速（在數小時內）在引流淋巴結中誘導高水平的細胞因子和趨化因子。細胞內細胞因子染色和轉錄組學研究表明，這些炎癥反應很大程度上可以是淋巴結自身產生的因子，盡管細胞因子/趨化因子也可以通過淋巴管從注射部位快速運輸到淋巴結。

這種淋巴結局部的炎癥在某些情況下可能反映了佐劑對淋巴結內細胞的直接影響，因為顆粒狀和分子佐劑已被證明可以在注射后幾分鐘到數小時內通過淋巴運輸到達引流淋巴結。對于基于危險信號的分子佐劑，這可能反映了佐劑直接刺激髓系細胞或淋巴細胞。或者，佐劑可以激活細胞死亡和應激反應途徑。例如，油包水佐劑已被證明可以誘導淋巴結髓系細胞的內質網應激和上調未折疊蛋白反應（UPR）途徑，從而在引流淋巴結中產生炎癥細胞因子和趨化因子。明礬和油包水乳劑佐劑也可以激活炎癥體的組分，從而引發類似的淋巴結炎癥，盡管不同佐劑所需的炎癥體復合體的關鍵組分可能不同。值得注意的是，UPR相關基因的早期激活已被證明是人流感疫苗中保護性抗體滴度的生物標志物。如上所述，許多佐劑會迅速誘導竇襯巨噬細胞的死亡，細胞死亡機制（如焦亡）可能在進一步塑造淋巴結內的先天免疫激活中發揮重要作用。這些途徑會導致特定細胞因子（如IL-18和IL-1β）的釋放，這些細胞因子在響應常見的危險信號刺激（如單獨的Toll樣受體激動劑）時通常不會被釋放到細胞外。

這些因子的上調通常會伴隨著明顯的淋巴結腫大（淋巴結質量可增加五倍）以及在24小時內從血液和/或淋巴中募集先天免疫細胞和淋巴細胞到引流淋巴結。這大大增加了淋巴結中可用的淋巴細胞總數，這種擴張可以持續長達2周。快速的免疫細胞募集與佐劑在引流淋巴結中對抗原積累的影響相結合，增加了罕見的T細胞和B細胞前體與同源抗原相遇的可能性。與此同時，淋巴結局部的炎癥還激活了APCs，以促進有效的T細胞和B細胞激活。APCs（包括傳統樹突狀細胞、漿細胞樣樹突狀細胞、巨噬細胞、單核細胞和B細胞）被佐劑激活，上調MHC和共刺激受體，從而促進抗原呈遞。與整體淋巴結炎癥類似，APCs的激活可以通過危險感受器佐劑對其受體的直接作用，或者通過激活這些細胞中的應激反應途徑來誘導。此外，如油包水乳劑所示，因佐劑誘導的炎癥而被募集到引流淋巴結的單核細胞可以被誘導分化為單核細胞來源的樹突狀細胞，從而在隨后的免疫反應中參與抗原呈遞。有趣的是，與初次免疫反應相比，加強免疫后先天免疫細胞中誘導的基因表達模式可能不同，這表明初次免疫對后續劑量佐劑的作用具有反饋效應。總之，促進引流淋巴結中的先天免疫激活是佐劑的關鍵機制之一。

改變抗原呈遞和淋巴細胞效應分化

除了促進抗原在dLN中的累積外，一些佐劑還直接影響APCs在單細胞水平上對抗原的攝取、處理和/或遞呈。將細胞外抗原通過I類MHC分子呈遞是一種疫苗可以用來促進CD8陽性T細胞反應的機制。此外，佐劑還可以影響CD4陽性T細胞的激活。在人類中，將油包水佐劑與裂解型流感疫苗聯合使用被證明可以誘導循環單核細胞和樹突狀細胞中抗原處理和呈遞基因的表達。佐劑在樹突狀細胞中誘導的細胞因子環境和激活狀態直接影響CD4陽性T細胞的分化。

訓練免疫（trained immunity）

盡管疫苗的設計目的是誘導持久的抗原特異性適應性免疫，但越來越多的證據表明，某些疫苗（如卡介苗（BCG）、Shingrix和口服脊髓灰質炎疫苗）可以以抗原非特異性的方式提供對不相關感染的異源保護。這些流行病學觀察結果得到了臨床前研究的補充，這些研究表明BCG疫苗接種可以提供針對廣泛病毒（如流感病毒和SARS-CoV-2）的保護。在BCG疫苗接種的情況下，人們推測疫苗對不相關病原體的有益效果至少部分是通過誘導先天免疫記憶（或訓練免疫）實現的。訓練免疫是指髓系細胞及其前體的長期轉錄、表觀遺傳和代謝重編程，從而在再次遇到微生物時導致先天免疫反應的增強或減弱。佐劑能夠特異性靶向先天免疫系統的模式識別受體（PRRs），促使人們認為佐劑可以通過誘導訓練免疫來增強疫苗的免疫原性和效力。

在疫苗接種的背景下，幾種PRR激動劑也可以觸發髓系細胞的長期重編程。TLR7/8激動劑3M-052已被證明在小鼠髓系細胞中誘導長期的轉錄組和表觀基因組特征。單核細胞顯示出ISG、干擾素調節因子（IRF）和信號轉導及轉錄激活因子（STAT）基因位點的基因表達增加和可及性增加，這些變化在免疫后持續長達28天。油包水納米乳劑佐劑MF59同樣在初次免疫后誘導了先天免疫的持久轉錄特征。此外，MF59疫苗接種誘導了先天免疫的轉錄特征水平增加，尤其是在加強免疫后髓系細胞的激活增強，表明誘導了訓練免疫。

這些發現表明，佐劑可以被用來持久地重編程先天免疫系統，以在疫苗接種后觸發增強的免疫反應。

mRNA疫苗中的佐劑活性

核酸疫苗研發已有30多年歷史，指的是將重組 DNA 或 RNA 抗原遞送至宿主細胞。mRNA 疫苗在新冠疫情期間憑借脂質納米顆粒（LNP）遞送技術，首次大規模證明了這種亞單位疫苗方法的安全性和有效性。這些mRNA 疫苗的成功，部分得益于用合成替代物替換 mRNA 中的某些天然堿基，可顯著降低細胞對重組 mRNA 的先天免疫識別，提高其穩定性，增加翻譯效率并延長其存續。例如，輝瑞-BioNTech 和 Moderna 的新冠 mRNA 疫苗均采用了核苷修飾，將尿苷替換為 N1-甲基假尿苷，這種修飾能夠增強 mRNA 的翻譯效率，同時避免過度激活先天免疫反應。

mRNA 疫苗研發速度快、成本較傳統蛋白疫苗低，且具有平臺性質，即相同的生產工藝可應用于每種新疫苗產品，這些優勢使其在應對未來大流行/流行病病原體暴發時具有重要意義。

目前，基于修飾堿基 mRNA 的新冠疫苗和呼吸道合胞病毒疫苗以及基于α病毒衍生的自復制 RNA 的新冠疫苗已獲臨床批準，還有更多疫苗候選產品處于臨床試驗的后期階段。所有獲批的 RNA 疫苗均基于 LNP 遞送的 mRNA。這些 LNP 制劑通常由 pH 敏感的可電離脂質、輔助脂質和膽固醇組成，其研發重點是保護 RNA 免受核酸酶的提前降解，促進細胞攝取和內質網逃逸，從而在宿主細胞的細胞質中翻譯編碼的抗原。然而，LNP 也具有重要的佐劑活性。在臨床前模型中，將空 LNP 與蛋白抗原混合時，空 LNP 是一種強效佐劑，可促進依賴于可電離脂質成分的TFH和生發中心 B 細胞的發育。空的LNP 在給藥后幾小時內可在dLNs中誘導高水平的 IL-6。攜帶修飾堿基 mRNA 的 LNP 和由非修飾堿基 mRNA 形成的脂質復合物（RNA-LPX）均能強烈激活人、小鼠和非人靈長類動物細胞產生 IL-1β。IL-1β是把雙刃劍，既助于小鼠在 mRNA 疫苗接種后 CD8 +T 細胞的啟動和早期記憶發育，同時也是 mRNA 疫苗高劑量出現毒性的關鍵因素之一。

另外，已上市mRNA疫苗中使用的LNP還有進一步優化和調整空間。通過篩選脂質制劑庫已發現一些 LNP 在體外和體內顯示出增強的轉染能力和 DC 激活能力，與獲批的新冠 LNP 制劑相比，可增強癌癥疫苗的 T 細胞啟動。

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