CAR-T細(xì)胞治療藥物的生產(chǎn)制備和表征

在過(guò)去的幾十年中，基于嵌合抗原受體（CAR）T細(xì)胞的細(xì)胞療法徹底改變了癌癥的治療方式，尤其是血液系統(tǒng)疾病。CAR-T細(xì)胞是經(jīng)過(guò)基因工程改造的T淋巴細(xì)胞，能夠識(shí)別特定抗原，其結(jié)構(gòu)由四個(gè)部分組成。第一部分是外部結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)與靶抗原結(jié)合，決定了CAR-T的親和力和特異性。它通常由單鏈可變片段（scFv）組成。第二部分是鉸鏈區(qū)，通常由IgG1或IgG4的鉸鏈-CH2-CH3Fc結(jié)構(gòu)域，或CD4、CD8、CD3ζ或CD28的部分組成。鉸鏈區(qū)對(duì)于CAR-T細(xì)胞激活，并攻擊腫瘤靶細(xì)胞至關(guān)重要。它還連接scFv與CAR結(jié)構(gòu)的第三部分——跨膜區(qū)。跨膜區(qū)調(diào)節(jié)CAR信號(hào)傳導(dǎo)，并控制CAR在T細(xì)胞表面的表達(dá)。CAR結(jié)構(gòu)的最后一個(gè)部分是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)，其組成在不同代CAR-T細(xì)胞中有所不同，但所有CAR-T細(xì)胞中均包含CD3ζ信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)。

CAR技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于其對(duì)靶抗原的特異性和對(duì)腫瘤細(xì)胞的強(qiáng)大細(xì)胞毒性。隨著CAR-T細(xì)胞的發(fā)展，細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)不斷優(yōu)化，以降低毒性并提高效率。第一代CAR-T細(xì)胞結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單，僅包含外部結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域以及CD3ζ作為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)。第二代CAR-T細(xì)胞在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)增加了共刺激結(jié)構(gòu)域（如CD28或4-1BB），以增強(qiáng)T細(xì)胞多次暴露于抗原后的增殖能力。第三代CAR-T細(xì)胞同時(shí)包含CD28和4-1BB兩種共刺激結(jié)構(gòu)域。第四代CAR-T細(xì)胞也稱為“T細(xì)胞重定向用于通用細(xì)胞因子殺傷（TRUCK）”，其特點(diǎn)是增加了細(xì)胞因子（如IL-12）的表達(dá)模塊。這些細(xì)胞因子由CAR-T細(xì)胞釋放，用于調(diào)節(jié)T細(xì)胞反應(yīng)、增強(qiáng)NK細(xì)胞的激活，并將巨噬細(xì)胞極化為對(duì)抗腫瘤細(xì)胞的M1表型。除了IL-12，IL-2、IL-7、IL-10、IL-15、IL-18、IL-23和IL-27等細(xì)胞因子也在研究中。第五代CAR-T細(xì)胞結(jié)構(gòu)中包含截短的細(xì)胞質(zhì)IL-2受體β鏈結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域能夠與轉(zhuǎn)錄因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和激活轉(zhuǎn)錄因子3（STAT3）結(jié)合。當(dāng)T細(xì)胞與抗原結(jié)合時(shí)，會(huì)同時(shí)激活TCR（通過(guò)CD3ζ結(jié)構(gòu)域）、共刺激結(jié)構(gòu)域（CD28結(jié)構(gòu)域）以及細(xì)胞因子JAK-STAT3/5信號(hào)通路。IL-2受體β鏈結(jié)構(gòu)域和JAK-STAT通路可促進(jìn)細(xì)胞增殖，防止細(xì)胞終末分化。

CAR-T細(xì)胞療法在治療B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病（B-ALL）和彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（DLBCL）患者中取得了前所未有的高完全緩解（CR）率。截至目前，F(xiàn)DA已經(jīng)批準(zhǔn)了7款基于CAR-T細(xì)胞的療法，相關(guān)信息總結(jié)如下表。

CAR-T細(xì)胞療法的有效性無(wú)可爭(zhēng)議，但這種治療方法也有其局限性。只有少數(shù)接受治療的患者實(shí)現(xiàn)了CR。同時(shí)，許多患者遭受了嚴(yán)重的毒性，包括細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS）、免疫效應(yīng)細(xì)胞相關(guān)神經(jīng)毒性綜合征（ICANS），甚至在某些情況下導(dǎo)致死亡。此外，相當(dāng)數(shù)量的患者（高達(dá)66%）在治療后出現(xiàn)復(fù)發(fā)。

CAR-T細(xì)胞療法的成功與否在很大程度上受到生產(chǎn)過(guò)程的影響。每一個(gè)步驟都面臨挑戰(zhàn)，并且可以進(jìn)一步改進(jìn)。比如自體或異體T細(xì)胞的收集，以及它們?cè)谳斪⑶暗暮慕郀顟B(tài)，對(duì)CAR-T細(xì)胞療法的療效有重大影響。另外，體外過(guò)度刺激T細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致其早期耗竭，而轉(zhuǎn)染方法可能導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。本文總結(jié)了體外CAR-T細(xì)胞的純化、擴(kuò)增和表征方法。

起始物料選擇

自體和異體移植

CAR-T細(xì)胞制造的初始步驟是選擇和收集起始材料。在自體CAR-T細(xì)胞療法中，T細(xì)胞是從患者體內(nèi)提取的，并在經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)室改造后重新輸注回同一位患者體內(nèi)。而在異體移植（通常稱為“現(xiàn)貨型/健康供體”）中，T淋巴細(xì)胞來(lái)源于健康供體，并被輸注給癌癥患者。這兩種程序各有優(yōu)缺點(diǎn)。

自體移植的優(yōu)點(diǎn)是沒(méi)有移植物抗宿主病（GvHD）的風(fēng)險(xiǎn)，并且與異體移植相比，細(xì)胞在體內(nèi)的持久性更長(zhǎng)。然而，自體T細(xì)胞療法也面臨諸多挑戰(zhàn)，包括復(fù)雜的生產(chǎn)過(guò)程、高成本、T細(xì)胞的變異性、由于先前腫瘤治療導(dǎo)致的T細(xì)胞耗竭和功能障礙等。CAR-T細(xì)胞的療效在很大程度上取決于純化T淋巴細(xì)胞的特性，而這些特性可能受到患者年齡、癌癥類型、既往治療以及T細(xì)胞被癌細(xì)胞污染風(fēng)險(xiǎn)等因素的影響。為解決自體CAR-T細(xì)胞移植的挑戰(zhàn)，異體CAR-T細(xì)胞療法被作為一種潛在解決方案。異體療法提供了一種均質(zhì)化、標(biāo)準(zhǔn)化且易于獲取的選項(xiàng)，成本較低，且有可能實(shí)現(xiàn)多次給藥。更重要的是，異體CAR-T細(xì)胞療法可能特別適合用于侵襲性腫瘤，因?yàn)樗水a(chǎn)品被惡性T細(xì)胞污染的風(fēng)險(xiǎn)。然而，異體移植的局限性包括GvHD的風(fēng)險(xiǎn)以及宿主介導(dǎo)的免疫排斥反應(yīng)，即受者的免疫細(xì)胞攻擊輸注的CAR-T細(xì)胞，從而削弱其療效。

為緩解這些問(wèn)題，已開(kāi)發(fā)出多種策略。例如，可通過(guò)使用抗CD52抗體（如阿侖單抗）來(lái)消除宿主的CD52+異體反應(yīng)性T細(xì)胞，這些細(xì)胞負(fù)責(zé)耗竭注入的CAR-T細(xì)胞。為此，必須在輸注前通過(guò)基因編輯破壞CAR-T細(xì)胞內(nèi)源性CD52的表達(dá)。基因編輯還可以靶向TCR和人類白細(xì)胞抗原（HLA），以進(jìn)一步降低異體反應(yīng)性。另一種策略是采集具有不同亞群的T淋巴細(xì)胞，例如攜帶γδTCR的T細(xì)胞，因?yàn)樗鼈兊募?xì)胞毒性比傳統(tǒng)用于CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的αβTCR更強(qiáng)。最后，重新輸注分化程度較低的細(xì)胞群體，如多能干細(xì)胞、前體T細(xì)胞或臍帶血細(xì)胞，可能會(huì)降低GvHD的風(fēng)險(xiǎn)。

T細(xì)胞富集方法

CAR-T細(xì)胞療法的起始材料是患者或供體的外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）。PBMCs由70%-90%的淋巴細(xì)胞組成（其中包括70%-85%的CD3+T細(xì)胞、5%-10%的B細(xì)胞和5%-20%的NK細(xì)胞），單核細(xì)胞占10%-20%，樹突狀細(xì)胞（DCs）占1%-2%。PBMCs通過(guò)白細(xì)胞分離術(shù)或密度梯度離心從全血中分離出來(lái)，然后清洗以去除抗凝劑、紅細(xì)胞和血小板等雜質(zhì)。去除血小板至關(guān)重要，因?yàn)檠“蹇梢耘c免疫細(xì)胞聚集，并表達(dá)可能被熒光抗體標(biāo)記的Fc受體，從而在流式細(xì)胞術(shù)中導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。

CAR-T細(xì)胞生產(chǎn)的第二步是通過(guò)選擇性富集T細(xì)胞群體。當(dāng)然，這一步是可選項(xiàng)。通常利用帶有抗體的磁珠進(jìn)行陰選和陽(yáng)選。比如，使用抗CD4/CD8或抗CD3抗體偶聯(lián)珠子。FDA批準(zhǔn)的其中6種CAR-T中，3種采用的陽(yáng)選。具體而言，Brexu-cel和Liso-cel是通過(guò)抗CD4/CD8抗體偶聯(lián)珠子進(jìn)行陽(yáng)選得到的，而Tisa-cel則是通過(guò)抗CD3/CD28抗體偶聯(lián)珠子進(jìn)行陽(yáng)選得到的。陽(yáng)選需要注意的是，當(dāng)細(xì)胞表面的受體被抗體結(jié)合時(shí)，細(xì)胞可能會(huì)接收到信號(hào)，從而改變其行為。比如，CD8和CD4的結(jié)合可以通過(guò)增加炎癥細(xì)胞因子的釋放和增強(qiáng)毒性，影響T細(xì)胞生物學(xué)，與CD3/CD28富集相比更為顯著。此外，CD3/CD28選擇還可以富集γδT細(xì)胞，而這些細(xì)胞由于表面缺乏CD4/CD8標(biāo)記，會(huì)被CD4/CD8選擇排除。γδT細(xì)胞的重要性在于其與良好預(yù)后密切相關(guān)，并具有天然的抗腫瘤功能。

陰性選擇是富集T淋巴細(xì)胞的有效替代方法，與通過(guò)CD4/CD8陽(yáng)性選擇獲得的CAR-T細(xì)胞相比，陰性選擇得到的CAR-T細(xì)胞在擴(kuò)增、轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和表型方面相似。該過(guò)程使用抗CD14、抗CD15、抗CD16、抗CD19和抗CD56抗體偶聯(lián)珠子的混合物，從PBMCs中去除單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞、NK細(xì)胞和B細(xì)胞，而T淋巴細(xì)胞則未受影響。陰性選擇已在臨床（如Cilta-cel）和臨床前研究中被使用。

由于T細(xì)胞是PBMCs的主要成分，許多團(tuán)隊(duì)選擇直接刺激它們，而無(wú)需專門富集T細(xì)胞群體。這種方法的可行性也得到了FDA批準(zhǔn)的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品（如Axi-cel和Ide-cel）的支持。下圖展示了FDA批準(zhǔn)的其中6款CAR-T產(chǎn)品的體外富集方法。

體外T細(xì)胞激活和分化

T細(xì)胞激活

CAR-T細(xì)胞的生產(chǎn)通常包括三個(gè)步驟：激活、轉(zhuǎn)染和體外擴(kuò)增，至少需要6天。在自然狀態(tài)下，CD8?和CD4?T細(xì)胞在與結(jié)合到MHCⅠ類或MHCⅡ類分子上的靶抗原相互作用后，會(huì)激活、增殖并分化為各種短壽命的效應(yīng)亞群。在體外，可以通過(guò)使用游離的或包被在磁珠上的抗CD3/CD28抗體來(lái)實(shí)現(xiàn)T細(xì)胞的激活，其中后者是體外T細(xì)胞激活最常用的方法，占CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的66%。在6種FDA批準(zhǔn)的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品中，有3種使用抗CD3/CD28抗體進(jìn)行T細(xì)胞激活，分別是Brexu-cel、Axi-cel和Ide-cel。常見(jiàn)的磁珠與細(xì)胞（B:C）比例為3:1。

當(dāng)T淋巴細(xì)胞通過(guò)與其對(duì)應(yīng)抗原結(jié)合而被激活時(shí)，它們會(huì)上調(diào)并表達(dá)如CD25和CD69等表面標(biāo)志物。CD25被認(rèn)為是晚期激活的通用標(biāo)志物，它是IL-2受體的一部分，在激活的淋巴細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞上高表達(dá)，其表達(dá)量與激活程度相關(guān)。而CD69在TCR/CD3結(jié)合后迅速誘導(dǎo)，被認(rèn)為是早期激活標(biāo)志物，在激活后30-60分鐘可檢測(cè)到，4-6小時(shí)后水平下降。

T細(xì)胞分化

細(xì)胞因子對(duì)CAR-T細(xì)胞的質(zhì)量和功能至關(guān)重要。IL-2、IL-7和IL-15影響T細(xì)胞的組成、質(zhì)量和表型，顯著影響CAR-T細(xì)胞療法的體內(nèi)療效。它們還可以在體外誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖。IL-2已廣泛用于CAR-T細(xì)胞生產(chǎn)的制造方案中，包括FDA批準(zhǔn)的療法，如Brexu-cel和Axi-cel（300U/mL）。其中，300U/mL和100U/mL是最常用的T細(xì)胞激活濃度，而較低的濃度如20U/mL、40U/mL、50U/mL和200U/mL也被使用。

盡管IL-2被廣泛使用，但它可能導(dǎo)致一種相對(duì)成熟的表型（CD62LlowCCR7+CD27+CD28+），這種表型更有利于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的擴(kuò)增，而不是記憶T細(xì)胞。因此，選擇富含記憶細(xì)胞的群體，特別是記憶T干細(xì)胞（TSCM）至關(guān)重要。這些細(xì)胞在體內(nèi)表現(xiàn)出更好的持久性、定植能力和療效，與分化程度更高的表型（如效應(yīng)T淋巴細(xì)胞）相比具有優(yōu)勢(shì)。TSCM的增強(qiáng)療效主要?dú)w因于它們能夠像干細(xì)胞一樣進(jìn)行多次細(xì)胞分裂，迅速生成高度增殖、自我更新、多能的后代細(xì)胞，這些細(xì)胞能夠快速對(duì)抗原產(chǎn)生響應(yīng)。T細(xì)胞的增殖和存活與抗腫瘤療效和體內(nèi)持久性相關(guān)，故富集TSCM和中央記憶T細(xì)胞（TCM）是CAR-T細(xì)胞療法的研究重點(diǎn)。可以通過(guò)在移植前限制T細(xì)胞的體外增殖以及刺激IL-7和IL-15受體來(lái)實(shí)現(xiàn)，這些受體可以減輕T細(xì)胞的終末分化，并增加記憶干細(xì)胞的比例。與用IL-2刺激的T細(xì)胞相比，用IL-7和IL-15刺激的T細(xì)胞表現(xiàn)出更低的耗竭標(biāo)志物表達(dá)、更高的促炎細(xì)胞因子分泌以及更強(qiáng)的抗腫瘤效果。然而，這個(gè)方向目前還有一些爭(zhēng)議，促進(jìn)TSCM富集的最佳細(xì)胞因子組合尚未明確。目前對(duì)于使用IL-7和IL-15也未沒(méi)有共識(shí)；一些團(tuán)隊(duì)甚至報(bào)告說(shuō)IL-2刺激可以誘導(dǎo)TSCM表型。此外，通過(guò)IL-7和IL-15刺激獲得的TSCM比例差異很大，范圍從10%-30%到60%-70%，這可能會(huì)影響CAR-T細(xì)胞的療效。

活化的T細(xì)胞轉(zhuǎn)染

病毒法轉(zhuǎn)染

病毒已經(jīng)成為CAR-T細(xì)胞基因改造的標(biāo)準(zhǔn)臨床方法。這種方法可以確保遺傳物質(zhì)整合到宿主細(xì)胞基因組中，實(shí)現(xiàn)高轉(zhuǎn)染率和轉(zhuǎn)基因的長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)。病毒載體主要有兩大類：γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒。γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒只能轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂細(xì)胞，因此需要激活細(xì)胞，而慢病毒可以轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂和靜止細(xì)胞。

在FDA批準(zhǔn)的其中6種CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品中，33%（Axi-cel和Brexu-cel）使用了γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒，而67%是基于慢病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。

目前，沒(méi)有確鑿證據(jù)表明哪種病毒載體更好。病毒載體的一個(gè)主要問(wèn)題是潛在的癌基因插入風(fēng)險(xiǎn)。然而，在臨床中尚未觀察到相關(guān)病例。此外，通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染生產(chǎn)慢病毒需要大量DNA，這會(huì)增加生產(chǎn)成本。慢病毒傾向于整合到轉(zhuǎn)錄活躍基因的內(nèi)含子中，從而降低了癌基因插入的風(fēng)險(xiǎn)。相比之下，γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒更傾向于整合到轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、增強(qiáng)子和啟動(dòng)子附近。

非病毒法轉(zhuǎn)染

穩(wěn)定基因轉(zhuǎn)移可以通過(guò)多種非病毒方法實(shí)現(xiàn)，包括轉(zhuǎn)座子、CRISPR/Cas9、mcDNA載體和納米顆粒（NPs）。

轉(zhuǎn)座子是能夠通過(guò)“剪切-粘貼”機(jī)制在基因組內(nèi)改變位置的DNA序列。這一過(guò)程依賴于轉(zhuǎn)座子和轉(zhuǎn)座酶。轉(zhuǎn)座子攜帶目標(biāo)基因，其兩側(cè)有反向末端重復(fù)序列，這些序列可被轉(zhuǎn)座酶結(jié)合。轉(zhuǎn)座子的優(yōu)點(diǎn)包括生產(chǎn)成本低、無(wú)需臨床級(jí)載體、能夠高效且永久地插入基因組，且比病毒方法更安全。此外，轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)染可以在激活的和靜止的原代T細(xì)胞中進(jìn)行。在最新一代的CAR-T細(xì)胞中，同時(shí)轉(zhuǎn)移多個(gè)基因至關(guān)重要，而轉(zhuǎn)座子特別適合這一目的，因?yàn)樗鼈兛梢詳y帶比病毒更大的遺傳物質(zhì)。然而，轉(zhuǎn)座子也有一些缺點(diǎn)，與病毒方法相比，生成CAR-T細(xì)胞所需時(shí)間更長(zhǎng)，轉(zhuǎn)染效率較低。兩種最常用的轉(zhuǎn)座子/轉(zhuǎn)座酶系統(tǒng)——SleepingBeauty(SB)和piggy-Bac——分別可實(shí)現(xiàn)25%-80%和20%-40%的T細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。

CRISPR/Cas9技術(shù)是轉(zhuǎn)座子的有前景的替代方法，可實(shí)現(xiàn)約20%-60%的CAR+細(xì)胞比例。該技術(shù)源自細(xì)菌和古菌的免疫系統(tǒng)，利用與目標(biāo)DNA序列互補(bǔ)的短RNA片段（導(dǎo)向RNA或gRNA），引導(dǎo)Cas9酶到達(dá)這些特定序列。Cas9隨后切割原始DNA，利用細(xì)胞的DNA修復(fù)機(jī)制引入新基因。CRISPR/Cas9是一種簡(jiǎn)單、靈活且精確的方法，可在基因組的預(yù)定位置整合多個(gè)轉(zhuǎn)基因。該技術(shù)當(dāng)前的挑戰(zhàn)包括優(yōu)化和標(biāo)準(zhǔn)化基因編輯過(guò)程以提高穩(wěn)定性和效率，以及減少或消除最近發(fā)現(xiàn)的基因組編輯的后果——染色體丟失。

另一種有效的非病毒機(jī)制是使用CARmcDNA載體結(jié)合電穿孔將CAR結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)染到T細(xì)胞中。這些mcDNA載體源自含有CAR序列的超螺旋親本DNA載體。在轉(zhuǎn)化到ZYCY10P3S2T大腸桿菌后，親本載體發(fā)生重組，產(chǎn)生兩個(gè)產(chǎn)物：CARmcDNA載體和一個(gè)包含細(xì)菌來(lái)源和抗生素基因的質(zhì)粒骨架。后者在培養(yǎng)基中加入L-阿拉伯糖后被I-SceI內(nèi)切酶降解。mcDNA載體的優(yōu)點(diǎn)包括由于缺乏殘留細(xì)菌成分而無(wú)免疫反應(yīng)，且在細(xì)胞內(nèi)持久存在。通過(guò)mcDNA轉(zhuǎn)染可實(shí)現(xiàn)超過(guò)50%的轉(zhuǎn)染效率，超過(guò)慢病毒方法。然而，從質(zhì)粒中去除細(xì)菌成分可能復(fù)雜，且常導(dǎo)致產(chǎn)量低和細(xì)菌基因組DNA污染。

2017年，史密斯等人發(fā)表了一篇有趣的文章，展示了載有CAR編碼質(zhì)粒的聚合物納米顆粒在體內(nèi)誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞表達(dá)CAR的效率，其特異性由抗CD3抗體介導(dǎo)的納米結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)。此后，還出現(xiàn)許多其他平臺(tái)，包括脂質(zhì)納米顆粒、納米管和各種聚合物納米結(jié)構(gòu)。然而，納米顆粒并非沒(méi)有局限性。擴(kuò)大生產(chǎn)工藝可能復(fù)雜，且必須認(rèn)真考慮納米顆粒的潛在毒性。

CAR-T細(xì)胞的細(xì)胞毒性

評(píng)估CAR-T細(xì)胞體外殺傷能力的第一步是進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。迄今為止，文獻(xiàn)中已經(jīng)描述了四種主要的實(shí)驗(yàn)方法：鉻（51Cr）釋放實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)（通過(guò)活/死細(xì)胞染色）、熒光素酶活性檢測(cè)以及細(xì)胞脫落（阻抗法）。每種方法都有其自身的優(yōu)缺點(diǎn)。

效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞（E:T）的比例是影響CAR-T細(xì)胞體外療效的最關(guān)鍵參數(shù)。文獻(xiàn)中已經(jīng)測(cè)試了多種E:T比例，例如1:1、3:1、5:1、10:1和20:1。這些研究評(píng)估了體外癌細(xì)胞的殺傷百分比以及細(xì)胞因子的釋放。由于抗原的差異、實(shí)體瘤與血液瘤的性質(zhì)不同以及CAR生成的具體情況，目前尚未就每種CAR-T細(xì)胞和癌細(xì)胞組合的最佳條件達(dá)成共識(shí)。通常，設(shè)置的E:T比例可導(dǎo)致血液和實(shí)體腫瘤細(xì)胞的殺傷率在40%到95%之間。

除了細(xì)胞毒性外，細(xì)胞因子定量是確定CAR-T細(xì)胞體外功能的最重要指標(biāo)之一。可以采用ELISA檢測(cè)。最常被定量的細(xì)胞因子包括INF-γ、IL-2和TNF-α，以及GM-CSF和顆粒酶B。酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)（ELISpot）、流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)胞內(nèi)染色（ICS）等方法也可以考慮。

引自：CAR-T Cell Manufacturing for Hematological and Solid Tumors: From the Preclinical to Clinical Point of View