詳解生物藥物的免疫原性（ADA形成過(guò)程、風(fēng)險(xiǎn)因素、風(fēng)險(xiǎn)測(cè)定、如果降低風(fēng)險(xiǎn)、對(duì)ADME影響、ADA檢測(cè)等）

包括抗體在內(nèi)的治療性蛋白已經(jīng)在多個(gè)治療領(lǐng)域取得突破，成為主要治療選擇之一。然而，機(jī)體產(chǎn)生的各種“負(fù)面”的免疫反應(yīng)是開(kāi)發(fā)蛋白藥物的挑戰(zhàn)之一，包括抗藥抗體（ADA）、免疫相關(guān)輸注反應(yīng)、過(guò)敏、細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS）等。其中，ADA是評(píng)估免疫原性的主要指標(biāo)。ADA既可以通過(guò)阻斷作用位點(diǎn)，直接中和蛋白藥物的藥效，也可以通過(guò)加速藥物清除間接影響藥效。輝瑞開(kāi)發(fā)的PCSK9抗體bococizumab就因?yàn)樵诙鄠€(gè)Ⅲ期臨床研究中發(fā)現(xiàn)了高比例的ADA，并影響藥效，最終停止開(kāi)發(fā)。除了有效性，ADA對(duì)安全性也是個(gè)隱患。比如嚴(yán)重輸血依賴(lài)性腎功能衰竭患者，皮下注射重組促紅細(xì)胞生成素治療，可能會(huì)引發(fā)貧血，就與產(chǎn)生的中和抗體相關(guān)。

當(dāng)然，并不是ADA發(fā)生率高，就一定會(huì)影響藥物成藥，需要衡量臨床的獲益-風(fēng)險(xiǎn)比。例如，抗TNFα抗體阿達(dá)木單抗是一種臨床成功的藥物，已獲得至少九種不同慢性炎癥適應(yīng)證的批準(zhǔn)。此外，阿達(dá)木單抗位列有史以來(lái)最暢銷(xiāo)治療藥物之一，蟬聯(lián)全球藥王好多年，其峰值年銷(xiāo)售額超過(guò)200億美元。然而，雖然不同數(shù)據(jù)有些出入，阿達(dá)木單抗的ADA發(fā)生率在3% -61%之間。甚至有些研究顯示，高水平的ADA會(huì)影響阿達(dá)木單抗的暴露量并降低治療效果。

阿達(dá)木的案例并不意味著沒(méi)有臨床后果，就可以默認(rèn)高濃度ADA存在。畢竟ADA對(duì)安全性和有效性的風(fēng)險(xiǎn)是客觀存在的，如果在臨床階段將ADA研究透徹，以確定ADA與療效、藥代動(dòng)力學(xué)或安全性之間是否存在相關(guān)性，需要進(jìn)行大樣本評(píng)估，費(fèi)用和時(shí)間成本都很高。輝瑞的PCSK9抗體就是個(gè)很好的例子，項(xiàng)目推進(jìn)到Ⅲ期階段再折戟的代價(jià)太高。最好還是從源頭控制蛋白藥物的ADA風(fēng)險(xiǎn)。本文圍繞蛋白藥物的免疫原性這一主題展開(kāi)討論。之前寫(xiě)過(guò)一篇類(lèi)似主題，，本文作了進(jìn)一步補(bǔ)充和完善。

ADA的形成

ADA的產(chǎn)生是一個(gè)涉及多步驟的復(fù)雜過(guò)程，先天免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)均參與其中。這一過(guò)程通常從來(lái)自先天免疫系統(tǒng)的抗原遞呈細(xì)胞（APCs）開(kāi)始。蛋白藥物經(jīng)過(guò)靜脈或皮下等系統(tǒng)給藥途徑進(jìn)入體內(nèi)后，在到達(dá)靶部位之前，就會(huì)遇到來(lái)自血液、皮膚或淋巴管中的APCs（如樹(shù)突狀細(xì)胞, DC），代表性的DC細(xì)胞群包括皮膚中的DC、血液中的漿細(xì)胞樣DC、肝臟中的枯否細(xì)胞及大腦中的小膠質(zhì)細(xì)胞。這群細(xì)胞可以整合生物分子本身及其周?chē)h(huán)境中的信號(hào)，并轉(zhuǎn)化為內(nèi)部下游信號(hào)，最終決定是免疫耐受還是產(chǎn)生免疫原性。DC細(xì)胞幾乎存在于人與外界環(huán)境接觸的所有區(qū)域。

DC通過(guò)內(nèi)吞作用攝取蛋白藥物。DC細(xì)胞吸收蛋白藥物主要依賴(lài)兩條路徑：1）降解途徑，即通過(guò)酸性小體/溶酶體將蛋白分解成肽段，并加載到主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ上，之后呈遞到細(xì)胞表面；2）非降解途徑，通過(guò)內(nèi)吞、再循環(huán)、再釋放，延長(zhǎng)生物藥半衰期。

降解途徑主要通過(guò)幾個(gè)表面受體家族和受體非依賴(lài)的巨胞飲作用實(shí)現(xiàn)。目前研究比較多的受體包括：1）模式識(shí)別受體，比如熱休克蛋白受體或Toll樣受體；2）C-type lectin家族，如DEC-205、DC-SIGN；3）Fcγ受體；4）MHC-Ⅱ蛋白家族，如HLA-DR、HLA-DQ；5）CD1蛋白家族；6）補(bǔ)體受體。這些受體可以使不成熟DC捕獲、內(nèi)吞大量蛋白藥物，比如治療性抗體、多肽、脂質(zhì)、多糖或糖蛋白。不成熟DC細(xì)胞還能以巨胞飲這種被動(dòng)擴(kuò)散的非受體依賴(lài)的形式攝取目標(biāo)蛋白。

DC細(xì)胞的非降解途徑主要通過(guò)3個(gè)受體實(shí)現(xiàn)：1）甘露糖受體；2）FcγRⅡB；3）新生兒受體（FcRn）。甘露糖受體通過(guò)結(jié)合含甘露糖的蛋白，介導(dǎo)其內(nèi)吞，并轉(zhuǎn)運(yùn)至再循環(huán)內(nèi)體中，阻止了被溶酶體降解。FcγRⅡB可以捕獲蛋白藥物-抗藥抗體免疫復(fù)合物（ICs），并將ICs再循環(huán)到細(xì)胞表面，主要意義在于保護(hù)了外周的ICs，被DC從外周順利運(yùn)送至脾臟，并激活B細(xì)胞。相反，肝臟枯否細(xì)胞表面的FcγRⅡB結(jié)合ICs后，會(huì)直接將其轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體，并發(fā)生降解，從而降低了藥物的半衰期。所以，不同解剖位置的DC細(xì)胞表面的FcγRⅡB介導(dǎo)的作用有可能是完全相反的。FcRn這個(gè)受體大部分人相對(duì)比較熟悉，具備延長(zhǎng)IgG分子半衰期的作用。DC細(xì)胞表面的不同受體及配體清單如下表所示。

DC細(xì)胞的攝取、處理和遞呈只是走完了ADA形成的第一步。作為T(mén)細(xì)胞表位的降解肽段，會(huì)與DC表面的MHC-II分子形成非共價(jià)分子復(fù)合物。這些肽-MHC-II復(fù)合物會(huì)被適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中CD4+輔助性T細(xì)胞表面的相應(yīng)T細(xì)胞受體（TCRs）特異性識(shí)別，從而激活輔助性T細(xì)胞，進(jìn)而激活適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中的特定B細(xì)胞。T細(xì)胞和B細(xì)胞之間的這種相互作用也依賴(lài)于TCR對(duì)特定肽-MHC-II復(fù)合物的識(shí)別。同時(shí)，這些B細(xì)胞還會(huì)通過(guò)膜結(jié)合抗體（即B細(xì)胞受體，BCRs）選擇性識(shí)別蛋白藥物上的B細(xì)胞表位。這一免疫過(guò)程最終導(dǎo)致B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞，漿細(xì)胞分泌抗藥抗體。這其中，Na?ve B細(xì)胞激活又分為CD4+T細(xì)胞依賴(lài)型和非依賴(lài)型。不過(guò)，超過(guò)90% ADA的形成是依賴(lài)CD4+T細(xì)胞的。

CD4+T細(xì)胞非依賴(lài)型：BCR識(shí)別的表位（B cell epitope）既可以是線性的，也可以是3D空間結(jié)構(gòu)。如果脾臟邊緣區(qū)的B細(xì)胞直接與攜帶抗原的DC細(xì)胞接觸，就可以不依賴(lài)T細(xì)胞，直接活化B細(xì)胞。這種抗原有一定特征，通常是帶有重復(fù)的蛋白表位或某些多糖（如革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞壁中的重復(fù)多糖），這些抗原可以直接通過(guò)交聯(lián)多個(gè)BCRs或同時(shí)激活BCRs和Toll樣受體來(lái)直接激活B細(xì)胞。交聯(lián)可以增強(qiáng)信號(hào)強(qiáng)度，對(duì)其它輔助細(xì)胞的依賴(lài)就會(huì)減弱。另外，這類(lèi)ADA通常是IgM亞型，且與抗原的親和力偏低。最后，這類(lèi)ADA反應(yīng)不具備免疫記憶性。

CD4+T細(xì)胞依賴(lài)型：與IgM相反，IgG、IgE亞型的ADA通常是高親和力、具備免疫記憶，且依賴(lài)CD4+T細(xì)胞。與B細(xì)胞識(shí)別的表位不同，T細(xì)胞識(shí)別的表位通常是12-30個(gè)氨基酸的短的線性肽。主要是由DC或B細(xì)胞降解產(chǎn)生，并由MHC-Ⅱ遞呈到細(xì)胞表面。當(dāng)CD4+T細(xì)胞識(shí)別這些肽段后，在共刺激分子協(xié)助下，開(kāi)始增殖，分泌細(xì)胞因子。當(dāng)活化的CD4+T細(xì)胞遇到含有相同肽段的B細(xì)胞后，就會(huì)促進(jìn)這些B細(xì)胞活化、分化，形成可分泌IgG、IgE亞型ADA的漿細(xì)胞。

ADA產(chǎn)生過(guò)程如下圖所示。

蛋白質(zhì)治療藥物首次引發(fā)的ADAs通常是低親和力的IgM型抗體。隨后，B細(xì)胞中的DNA重組會(huì)導(dǎo)致抗體亞型轉(zhuǎn)換為IgG、IgE或IgA。此外，抗體基因的快速突變（體細(xì)胞高頻突變）可能會(huì)產(chǎn)生更高親和力的抗體變體，這一過(guò)程稱(chēng)為親和力成熟。在免疫反應(yīng)成熟過(guò)程中，還可能發(fā)生表位擴(kuò)展，導(dǎo)致ADAs針對(duì)蛋白藥物上其他表位。

抗體治療藥物與其相應(yīng)抗原之間形成的免疫復(fù)合物可以促進(jìn)抗原呈遞和ADA形成。例如，抗TNFα抗體英夫利西單抗與TNFα形成的免疫復(fù)合物會(huì)增加APCs呈遞英夫利西單抗衍生肽段的MHC-II類(lèi)分子。抗TNF/TL1A雙特異性抗體AMG966在幾乎所有接受治療的健康志愿者中都引發(fā)了ADA，導(dǎo)致藥物暴露量減少。AMG966與TNF和TL1A形成了大的免疫復(fù)合物，增強(qiáng)了其去糖基化Fc與FcγR1A和FcγRIIIA的結(jié)合。免疫復(fù)合物與FcγR的結(jié)合有助于AMG966的ADA產(chǎn)生。

ADA危險(xiǎn)因素和免疫耐受

以疫苗為例，疫苗抗原被DC攝取后，T和B細(xì)胞并不足以被激活，不能形成足夠的中和抗體。這就不得不提到佐劑的作用。佐劑主要是提供共刺激信號(hào)，上調(diào)DC和B細(xì)胞表面共刺激分子的表達(dá)，如CD40、CD86。或者上調(diào)活化T細(xì)胞表面CD40配體的表達(dá)。可以發(fā)揮類(lèi)似佐劑作用的物質(zhì)包括內(nèi)毒素、熱休克蛋白、細(xì)菌肽、脂類(lèi)、多糖、病毒RNA/DNA序列。對(duì)于生物藥來(lái)講，則可以是雜質(zhì)、賦形劑，如表面活性劑或金屬離子。甚至注射針頭給藥刺激，也會(huì)提供共刺激信號(hào)。以上都可以作為提升ADA風(fēng)險(xiǎn)的危險(xiǎn)信號(hào)。

有危險(xiǎn)信號(hào)，自然也有免疫耐受情況。目前有以下幾種方式可以誘導(dǎo)外周免疫耐受：1）激活天然CD4+CD25+FoxP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，即nTreg；2）蛋白本身包含Treg表位，即Tregitopes；3）誘導(dǎo)抑制性DC產(chǎn)生，這類(lèi)DC細(xì)胞可分泌IL-10，并促進(jìn)誘導(dǎo)型Treg(iTreg)產(chǎn)生；4）誘導(dǎo)漿細(xì)胞樣DC產(chǎn)生，這類(lèi)DC細(xì)胞可激活Treg，抑制效應(yīng)T細(xì)胞作用；5）口腔粘膜給藥，有證據(jù)表明當(dāng)其它給藥途徑會(huì)產(chǎn)生高滴度ADA的干擾素，經(jīng)粘膜給藥后，免疫原性消失。所以，臨床有開(kāi)發(fā)干擾素α2b噴霧劑。原理也是與激活抑制性DC和iTreg有關(guān)；6）高劑量給藥誘導(dǎo)免疫耐受：Infliximab或Abciximab重復(fù)高劑量給藥后，免疫原性降低。推測(cè)原因是這類(lèi)蛋白含有Tregitopes，激活nTreg需要DC細(xì)胞表面的高拷貝數(shù)的HLA-Tregitope，所以劑量越高，激活Treg的可能性越高。

影響ADA產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)因素

蛋白藥物的免疫原性受到多種風(fēng)險(xiǎn)因素的影響，這些風(fēng)險(xiǎn)因素分為三大類(lèi)：與產(chǎn)品相關(guān)、與患者相關(guān)以及與疾病相關(guān)，每一類(lèi)又能具體細(xì)分為很多亞類(lèi)，如下表所示。

1、產(chǎn)品方面

首先比較重要的是藥物分子本身的特點(diǎn)，或者“先天因素”，首當(dāng)其沖的就是氨基酸序列。嵌合抗體或融合蛋白中的非人源序列會(huì)增加免疫原性風(fēng)險(xiǎn)。但是，與分子量大的蛋白藥物相比，含非人源序列的短肽更容易成為T(mén)細(xì)胞表位，免疫原性風(fēng)險(xiǎn)也會(huì)高很多。因?yàn)椋@類(lèi)短肽不需要內(nèi)吞或蛋白降解，可以直接與DC細(xì)胞表面的MHC-Ⅱ分子結(jié)合。

生物藥的聚體形式更容易成為B細(xì)胞表位，這類(lèi)聚體可通過(guò)交聯(lián)BCR激活B細(xì)胞，并且不需要共刺激信號(hào)，也不依賴(lài)T細(xì)胞的輔助。

除序列外，宿主細(xì)胞蛋白、化學(xué)合成多肽的副產(chǎn)物均會(huì)增加neo-epitopes風(fēng)險(xiǎn)，并可能發(fā)揮佐劑樣作用，增強(qiáng)共刺激，增加免疫原性風(fēng)險(xiǎn)。

產(chǎn)品制劑方面，純度、處方、劑量三個(gè)方面對(duì)免疫原性的影響需要考慮。尤其制劑的賦形劑成分，如表面活性劑，有增強(qiáng)共刺激信號(hào)的風(fēng)險(xiǎn)。

劑量和給藥方案對(duì)ADA的影響也很關(guān)鍵，比較低的劑量下，產(chǎn)生的T細(xì)胞表位數(shù)量少，可能達(dá)不到充分激活T細(xì)胞的閾值。非常高的劑量下，則有可能引起免疫耐受，抑制免疫反應(yīng)。除了給藥劑量，給藥頻率對(duì)ADA也有影響。每天給藥或更高頻的給藥方案，會(huì)導(dǎo)致Treg的激活，從而降低免疫原性風(fēng)險(xiǎn)。

藥物靶點(diǎn)和作用機(jī)制對(duì)ADA也有影響，有些靶點(diǎn)位于免疫細(xì)胞，具備免疫調(diào)節(jié)活性，這類(lèi)分子的免疫原性需要重點(diǎn)關(guān)注，比如CD40或CD25位于DC或其它APC細(xì)胞表面，產(chǎn)生ADA的風(fēng)險(xiǎn)較其它靶點(diǎn)要高。又如增強(qiáng)機(jī)體免疫的T細(xì)胞連接器，潛在ADA風(fēng)險(xiǎn)也會(huì)高一些。

2、患者和疾病方面

關(guān)于這點(diǎn)，需要重點(diǎn)考量的是患者的遺傳背景。首當(dāng)其沖的是人類(lèi)白細(xì)胞抗原Ⅱ（HLA-Ⅱ）的基因型，因?yàn)镠LA-Ⅱ決定著蛋白藥物是否攜帶合適的T細(xì)胞表位。再就是編碼全部TCR和BCR的基因，決定著能否識(shí)別任一T細(xì)胞或B細(xì)胞表位。此外，細(xì)胞因子基因多態(tài)性決定了T細(xì)胞和B細(xì)胞激活的閾值。其它風(fēng)險(xiǎn)因素包括患者給藥之前或平行服用的其它藥物。比如給予甲氨蝶呤或可的松這些免疫抑制藥物，自然會(huì)降低藥物的免疫原性風(fēng)險(xiǎn)。

不同疾病背景下，患者免疫狀態(tài)不同，比如腫瘤和自身免疫性疾病。以嵌合CD20抗體rituximab為例，在淋巴瘤和白血病患者的ADA發(fā)生率很低（<2%），但當(dāng)其用于治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎時(shí)，ADA發(fā)生率提高了10倍以上。

當(dāng)然，ADA的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)往往不是來(lái)自單一因素，而是多因素交織在一起，共同發(fā)揮作用，從而引起免疫原性相關(guān)的不良反應(yīng)或影響藥物的藥代動(dòng)力學(xué)行為。

免疫原性風(fēng)險(xiǎn)測(cè)定

在臨床前開(kāi)發(fā)階段，用于免疫原性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的方法通常聚焦在T細(xì)胞依賴(lài)性ADA生成中的各個(gè)步驟。通過(guò)一些工具預(yù)測(cè)線性肽與MHC-II結(jié)合的緊密程度，或者預(yù)測(cè)肽段（T細(xì)胞表位）被MHC-II遞呈的概率。通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬方法預(yù)測(cè)的T細(xì)胞表位數(shù)量與觀察到的臨床ADA發(fā)生率之間至少是存在一定的弱相關(guān)性的。

以上如果算作干實(shí)驗(yàn)，還有些濕實(shí)驗(yàn)方法可用于免疫原性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，比如樹(shù)突狀細(xì)胞負(fù)載實(shí)驗(yàn)（dendritic cell loading assays），模擬APCs對(duì)蛋白藥物的攝取。又如，APC中MHC-II遞呈的肽段，可以通過(guò)MHC相關(guān)肽段蛋白質(zhì)組學(xué)（MAPPs）識(shí)別。此外，也可以直接測(cè)量肽段與MHC-II的結(jié)合。輔助T細(xì)胞的激活可通過(guò)檢測(cè)生物標(biāo)志物（如IL-2分泌）或細(xì)胞表面CD134和CD137表達(dá)來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。T細(xì)胞增殖可通過(guò)使用熒光染料（如羧基熒光素琥珀酰亞胺酯）或通過(guò)[3H]-胸苷或溴脫氧尿苷摻入來(lái)測(cè)量。

免疫原性的評(píng)估除了體外工具可用，自然也離不開(kāi)體內(nèi)評(píng)估。只不過(guò)，體內(nèi)評(píng)估蛋白藥物的免疫原性風(fēng)險(xiǎn)存在諸多挑戰(zhàn)，因?yàn)榕R床前動(dòng)物模型和人體免疫原性結(jié)果的相關(guān)性有限。小鼠免疫系統(tǒng)與人體系統(tǒng)在ADA生成機(jī)制方面存在諸多差異，包括MHC庫(kù)和抗原呈遞。即使是可以產(chǎn)生人IgG1抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠，這種差異也依然存在。別說(shuō)小鼠，即使是非人靈長(zhǎng)類(lèi)比如猴，觀察到的ADA也不具備人體預(yù)測(cè)能力。比如抗體類(lèi)藥物，非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中ADA的發(fā)生率與人體相當(dāng)?shù)那闆r僅占約59%。

那么ADA風(fēng)險(xiǎn)怎么評(píng)估更合適呢？建議是多種不同方法交叉評(píng)估，包括基于計(jì)算機(jī)的T細(xì)胞表位預(yù)測(cè)、APC細(xì)胞對(duì)蛋白的攝取、通過(guò)MAPPs對(duì)MHC-II免疫肽組進(jìn)行特征分析等，并以不同ADA發(fā)生率的蛋白藥物作為對(duì)照，emicizumab為5.1%；etanercept為3.6%-8.7%；abciximab為5.8%-44%；romosozumab為18.1%；blosozumab為35%；hA33為62.2%；bococizumab為48%。

降低免疫原性風(fēng)險(xiǎn)

降低免疫原性風(fēng)險(xiǎn)的最簡(jiǎn)單方法是選擇一個(gè)符合目標(biāo)候選物特征且在不同免疫原性檢測(cè)中綜合評(píng)分較低的分子。如果沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這樣的低風(fēng)險(xiǎn)候選分子，可以選擇對(duì)更多候選物進(jìn)行免疫原性風(fēng)險(xiǎn)篩查。或者，也可以嘗試對(duì)現(xiàn)有候選物進(jìn)行去免疫原性處理，如去除可能的T細(xì)胞或B細(xì)胞表位。當(dāng)然，后者處理起來(lái)挑戰(zhàn)頗大，因?yàn)槿コ袧撛诘腡細(xì)胞表位比較耗時(shí)且難以實(shí)現(xiàn)，但保留下來(lái)的某一個(gè)T細(xì)胞表位也可能對(duì)ADA產(chǎn)生重大影響。而且，去免疫原性的同時(shí)，還要兼顧藥物的生物學(xué)活性和可開(kāi)發(fā)性，不能顧此失彼。Emicizumab是一款抗IXa/X雙特異性抗體，在分子設(shè)計(jì)階段通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬預(yù)測(cè)并隨后移除T細(xì)胞表位，即去免疫原性處理，在Ⅲ期臨床試驗(yàn)中觀察到的ADA發(fā)生率比較低（5.1%）。

對(duì)于抗體治療藥物，已采用多種方法來(lái)降低其免疫原性風(fēng)險(xiǎn)。在超過(guò)170種獲批的治療性抗體中，只有大約8種是鼠源抗體。因免疫原性問(wèn)題，鼠源抗體臨床開(kāi)發(fā)的成功率較低。意識(shí)到這一問(wèn)題之后，后續(xù)已經(jīng)開(kāi)發(fā)出多種技術(shù)，通過(guò)用人類(lèi)序列替換鼠源序列來(lái)降低鼠源抗體的免疫原性。包括20世紀(jì)80年代初提出的嵌合抗體——鼠源恒定區(qū)采用人源替代，僅保留結(jié)合抗原的鼠源可變區(qū)。幾年后，Greg Winter開(kāi)創(chuàng)了一種更復(fù)雜的蛋白質(zhì)工程方法，即抗體人源化。在人源化過(guò)程中，僅保留鼠源抗體中關(guān)鍵的互補(bǔ)決定區(qū)以及可變區(qū)中影響抗原結(jié)合的關(guān)鍵框架區(qū)殘基，而其余部分為人源序列替代。隨后，從20世紀(jì)90年代開(kāi)始，開(kāi)發(fā)出了高效的全人抗體生成途徑，包括人體抗體片段的噬菌體展示文庫(kù)和全人抗體轉(zhuǎn)基因小鼠。后續(xù)酵母展示文庫(kù)等其它技術(shù)進(jìn)一步加強(qiáng)了人源抗體的獲得路徑。當(dāng)然，高度人源化只是從概率上降低了ADA發(fā)生率，并不意味著與ADA低發(fā)生率之間的絕對(duì)相關(guān)。畢竟序列只是影響ADA發(fā)生的其中一個(gè)因素而已。

ADA對(duì)藥物ADME的影響

1、ADA對(duì)生物樣品分析結(jié)果的影響

如果形成ADA，那么蛋白藥物在體內(nèi)就有兩種存在形式，一是游離分子，二是與ADA結(jié)合的免疫復(fù)合物形式（ICs）。所以，我們需要弄清楚，建立的生物分析方法檢測(cè)的是哪些成分，是游離分子，是ICs，還是所有形式藥物總和。同理，如果建立的生物分析方法檢測(cè)不到血藥濃度了，也有幾種可能，一是ADA的結(jié)合影響了檢測(cè)，比如開(kāi)發(fā)的檢測(cè)配對(duì)抗體結(jié)合表位與ADA有交叉結(jié)合；二是ICs的形成加速了體內(nèi)清除的過(guò)程。前者情形說(shuō)明藥物還在以ICs形式在體內(nèi)循環(huán)，這種ICs可能依然具備藥理活性，應(yīng)該結(jié)合PK/PD結(jié)果進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，尤其是PK與PD不一致的時(shí)候。

2、免疫復(fù)合物的形成

ADA可以是中和抗體，也可以是非中和性質(zhì)的。中和抗體比較容易理解，就是抗藥抗體的結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)于藥物發(fā)揮生物學(xué)作用比較關(guān)鍵，比如結(jié)合在抗體藥物的CDR區(qū)域。非中和抗體則相反，結(jié)合位點(diǎn)不太關(guān)鍵。兩種類(lèi)型抗體都會(huì)影響藥物的清除，ADA產(chǎn)生的越多，這種影響越明顯。

ICs的大小取決于蛋白藥物表位的多少。如果藥物只有一個(gè)B細(xì)胞表位，僅形成小的ICs，不能形成大的或者交聯(lián)形式的復(fù)合物。相反，如果攜帶多個(gè)B細(xì)胞表位，則會(huì)形成比較大的ICs。特別提一下抗體藥物，因其結(jié)構(gòu)原因，抗體藥物如果有B細(xì)胞表位，一般至少是兩個(gè)。除了表位數(shù)量，藥物與抗藥抗體的比例也是影響ICs大小的關(guān)鍵。如果是1:1的比例，則容易形成下圖C和D中的IC形式。Johansson及其團(tuán)隊(duì)在體外將抗體與抗藥抗體1:1混合，發(fā)現(xiàn)主要形成的下圖C中的環(huán)狀四聚體，其次是D圖中的環(huán)狀六聚體，甚至還有八聚體和16-20聚體的存在。線性+開(kāi)環(huán)鏈?zhǔn)骄垠w（圖B）與環(huán)狀聚體占比分別為30.3%和67.8%。當(dāng)藥物與ADA的比例不是1:1，無(wú)論藥物過(guò)量還是ADA過(guò)量，更容易形成小片段的ICs。所以蛋白表位的多少及蛋白與抗藥抗體的比例對(duì)于ICs的形成、大小比較重要。

3、免疫復(fù)合物的清除

ICs的清除很大程度上取決于分子的大小。包含1個(gè)或2個(gè)IgG的小ICs既不能激活補(bǔ)體，也不能交聯(lián)Fcγ受體，可以持續(xù)在外周血循環(huán)，不會(huì)被免疫清除。大點(diǎn)的ICs可以激活補(bǔ)體，并被肝臟和脾臟的吞噬細(xì)胞攝取。沒(méi)有補(bǔ)體的情況下，也會(huì)被外周血中的DC、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞非特異性胞飲內(nèi)吞或被更有效率的受體介導(dǎo)的內(nèi)吞清除。這里請(qǐng)注意，DC細(xì)胞不只介導(dǎo)蛋白藥物的攝取、遞呈，也參與對(duì)后續(xù)形成的蛋白藥物/ADA的免疫復(fù)合物的清除。

聊幾句種屬差異，在人和靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中，IgG1和IgG3亞型ICs主要激活經(jīng)典的補(bǔ)體途徑，即先結(jié)合C1q，再結(jié)合C3b，之后結(jié)合紅細(xì)胞的補(bǔ)體受體（CR1），并被紅細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟或脾臟，最后通過(guò)FcγRⅠ、FcγRⅡA、FcγRⅢB、CR1、CR2、CR4或甘露糖受體被肝臟枯否細(xì)胞或脾臟巨噬細(xì)胞吞噬、清除。其中，F(xiàn)cγRⅠ與IgG單體的親和力很高（KD~10-9M），F(xiàn)cγRⅡA、FcγRⅢB與IgG單體的親和力就低很多，分別是>10-7M、>10-6M。因此，F(xiàn)cγRⅡA、FcγRⅢB主要介導(dǎo)多聚形式ICs的攝取。然而，嚙齒類(lèi)動(dòng)物并不是依賴(lài)紅細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)ICs的，而是血小板，這點(diǎn)是有種屬差別的。

ICs被吞噬細(xì)胞或造血細(xì)胞攝取后，主要暫存于早期內(nèi)體中。在pH<6.5的酸性pH條件下，ICs與FcγR的親和力消失，發(fā)生解離，轉(zhuǎn)而結(jié)合FcRn，并由FcRn完成后續(xù)的處理。對(duì)于單體IC（如上圖A中所示），F(xiàn)cRn的處理類(lèi)似于未形成復(fù)合物的免疫球蛋白藥物，發(fā)揮的是保護(hù)作用。但是，對(duì)于多聚ICs，則被FcRn轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體，并被降解，發(fā)揮清除作用。因此，F(xiàn)cRn給予不同大小ICs的待遇是不一樣的。

4、ADA是延長(zhǎng)蛋白藥物半衰期還是加速藥物清除？

對(duì)于分子量小于70KDa的蛋白藥物，主要經(jīng)腎臟消除，ADA的結(jié)合使分子量增加，不再經(jīng)過(guò)腎臟消除，可以增加藥物的持續(xù)時(shí)間。比如IL-2Rα，90%經(jīng)腎消除，半衰期約4.8h，結(jié)合ADA后，半衰期延長(zhǎng)到38h。又如IL-10，分子量35KDa左右，小鼠中的半衰期約0.04天，結(jié)合ADA后，半衰期延長(zhǎng)到1.16天。

對(duì)于分子量比較大的蛋白藥物，比如抗體，ADA通常會(huì)加快這類(lèi)藥物的清除。如果形成的是小的ICs，F(xiàn)cRn的保護(hù)作用雖然打了折扣，但還能保留幾成功力，所以只是在一定程度上加快了清除，但幅度有限。但是，大的ICs，不僅FcRn的保護(hù)作用完全失去，轉(zhuǎn)而會(huì)導(dǎo)致藥物的快速清除。即使產(chǎn)生的ADA是非中和抗體，這種清除速度也會(huì)使藥物藥效大打折扣。當(dāng)然，中和抗體性質(zhì)的ADA對(duì)藥物的影響就更嚴(yán)重了。但某些藥物ADA的形成是一過(guò)性的，當(dāng)ADA消退后，藥物的消除又回到正常狀態(tài)。當(dāng)然，還有些特例情況，比如中和性質(zhì)的ADA結(jié)合藥物后，會(huì)阻斷藥物與靶點(diǎn)的結(jié)合，降低靶點(diǎn)介導(dǎo)的藥物處置（TMDD），反而降低了藥物的清除。

案例：動(dòng)物試驗(yàn)中的加速清除

1.74mg/kg的Infliximab靜脈輸注給予食蟹猴，30分鐘后，再給予0.5mg/kg的anti-infliximab抗體。5分鐘后即形成ICs。大的ICs（>670KDa）被快速清除，24h的時(shí)候就已經(jīng)檢測(cè)不到。小的ICs可以持續(xù)存在，消除半衰期37.5h，比infliximab的105h短，但比大的ICs半衰期長(zhǎng)。

5、ADA對(duì)分布的影響

ADA不僅會(huì)對(duì)藥物的消除有影響，對(duì)分布的影響也不容忽視。對(duì)于小分子量的蛋白藥物，如多肽，ICs的形成會(huì)降低藥物的組織滲透能力，同時(shí)降低了藥物的腎清除，增加了在肝臟的富集和清除。比如，游離IL-10主要通過(guò)腎臟清除，腎臟的濃度明顯超過(guò)肝臟。當(dāng)結(jié)合抗IL-10抗體后，新的復(fù)合物主要分布到肝臟，腎臟只有很少的攝取。這點(diǎn)對(duì)于大分子量的生物藥也適用，當(dāng)結(jié)合抗藥抗體形成ICs后，肝臟和脾臟的分布及攝取增加，藥物清除速度加快。

ICs可能會(huì)在腎小球、血管、滑膜、肺、肝、皮膚、眼睛、脈絡(luò)叢等組織沉積。通常，小ICs較大ICs沉積的風(fēng)險(xiǎn)低。可能由于ICs清除路徑飽和，導(dǎo)致大的ICs不能被快速清除。將小ICs和大ICs混合后注入小鼠，只要血循環(huán)中存在大的ICs（>mAb2ADA2），ICs在腎小球的沉積就會(huì)被觀測(cè)到。還有一種解釋ICs組織沉積的理論，帶正電荷的ICs與細(xì)胞表面的負(fù)電荷的相互作用會(huì)促進(jìn)凝集。ICs沉積的危害還是挺大的，比如會(huì)引發(fā)腎小球腎炎的風(fēng)險(xiǎn)。

6、ADA對(duì)藥物吸收的影響

關(guān)于ADA對(duì)生物藥吸收影響的相關(guān)研究非常少。在給藥間隙如皮下，或者引流淋巴結(jié)是能發(fā)現(xiàn)ADA存在的。藥物經(jīng)過(guò)皮下給藥后，或經(jīng)過(guò)淋巴吸收后，會(huì)與ADA形成ICs，分子量出現(xiàn)比較大的變化，從而可能影響藥物吸收速率或程度。

如何處理ADA對(duì)ADME的影響

1、處理ADA存在情況下的PK檢測(cè)

無(wú)論開(kāi)發(fā)什么樣的PK檢測(cè)方法，檢測(cè)游離藥物的也好，檢測(cè)結(jié)合ADA的藥物也好，ADA對(duì)方法學(xué)準(zhǔn)確度的影響其實(shí)都會(huì)存在。不過(guò)，畢竟蛋白藥物大部分是人源序列，相對(duì)于動(dòng)物，人體的免疫原性風(fēng)險(xiǎn)是低的。一個(gè)簡(jiǎn)單粗暴的處理方法是，在計(jì)算PK行為時(shí)將ADA陽(yáng)性的個(gè)體排除在外。

2、通過(guò)高劑量給藥誘導(dǎo)免疫耐受

IFN-β臨床通過(guò)SC或IM給藥，治療多發(fā)性硬化癥。治療過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)中和抗體，并影響藥物的藥效。研究發(fā)現(xiàn)，臨床輸注高劑量IFN-β會(huì)降低中和抗體滴度。原因有二：1）短期輸注大量IFN-β會(huì)使中和抗體飽和，過(guò)量的IFN-β可以繼續(xù)發(fā)揮藥效；2）長(zhǎng)期看，高劑量IFN-β會(huì)引起免疫耐受。這一情況在IL-6受體抗體中也有發(fā)現(xiàn)。

3、通過(guò)免疫調(diào)節(jié)控制ADA負(fù)面影響

25%的A型血友病患者給予凝血因子VⅢ（FVⅢ）會(huì)產(chǎn)生中和抗體。如前文所述，通過(guò)提高劑量，給予大劑量FVⅢ可以抵消中和抗體的影響。不過(guò)，除了這個(gè)方法以外，最近的研究又出現(xiàn)了新的方案。通過(guò)將FVⅢ與CD20抗體rituximab聯(lián)用，也達(dá)到了降低中和抗體滴度，解除中和抗體負(fù)面調(diào)控的效果。主要原因是rituximab耗竭了B淋巴細(xì)胞，使抗體的產(chǎn)生受到影響。

又如治療龐貝病的酶替代療法-α葡萄糖苷酶（rhGAA）。兒童給予rhGAA后，會(huì)出現(xiàn)持續(xù)高滴度的中和抗體，極大的影響了治療效果。通過(guò)同時(shí)給予rituximab、甲氨蝶呤等免疫調(diào)節(jié)藥，可引起免疫耐受，降低ADA的影響。

TNF-α抗體infliximab是人鼠嵌合抗體，鼠源成分的比例較傳統(tǒng)人源化、全人源抗體高。臨床同樣面臨ADA影響生物利用度、增加輸注反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)的問(wèn)題。通過(guò)給予免疫抑制藥物如硫唑嘌呤、巰基嘌呤或甲氨蝶呤可以抑制ADA的形成，降低輸注反應(yīng)發(fā)生率，優(yōu)化治療效果。

4、其它新型克服免疫耐受的方法

一種是在藥物發(fā)現(xiàn)階段，就對(duì)序列中的T或B細(xì)胞表位進(jìn)行突變改造，從源頭降低風(fēng)險(xiǎn)。另外一種是通過(guò)改變給藥途徑降低ADA風(fēng)險(xiǎn)，比如鼻吸入給藥、消化道粘膜上皮給藥等更容易激活Treg，增強(qiáng)免疫耐受。

ADA的檢測(cè)

免疫原性評(píng)估應(yīng)納入每一項(xiàng)臨床研究的方案設(shè)計(jì)中。由于ADA的多克隆性和異質(zhì)性，無(wú)法為ADA樣本賦予一個(gè)絕對(duì)定量的濃度。相反，ADA反應(yīng)的強(qiáng)度通常以半定量的滴度單位表示。滴度值反映了ADA的濃度和親和力。ADA通常采用分層檢測(cè)策略來(lái)評(píng)估臨床研究樣本。目前常用的免疫原性檢測(cè)范式是篩選、確認(rèn)和表征（滴度檢測(cè)）三級(jí)檢測(cè)。篩選的目的是去除陰性樣本，畢竟不太可能對(duì)所有樣本開(kāi)展滴度檢測(cè)。但篩選也保留了一定的假陽(yáng)性率。所以，確認(rèn)這一步目的就是去除假陽(yáng)性樣本。最后一步是對(duì)確認(rèn)陽(yáng)性的樣本進(jìn)行滴度和中和活性檢測(cè)。目前有多種平臺(tái)可用于ADA分析，包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）和電化學(xué)發(fā)光免疫分析等。

典型的免疫原性三級(jí)檢測(cè)步驟如下圖所示，先對(duì)樣本進(jìn)行第一級(jí)的篩選，之后對(duì)篩選陽(yáng)性的樣本加樣確認(rèn)，最后對(duì)確認(rèn)陽(yáng)性的樣本進(jìn)行滴度檢測(cè)和中和活性確認(rèn)。實(shí)際工作中，并不是對(duì)所有階段的臨床樣本均進(jìn)行完整的三級(jí)檢測(cè)。比如，中和活性檢測(cè)通常在關(guān)鍵三期臨床才開(kāi)展。