淺談干細胞產品的臨床前藥理毒理研究

干細胞是一類具有自我更新和多向分化潛能的原始未分化細胞，它們在人體中扮演著重要的角色。干細胞能夠分化成多種類型的細胞，包括但不限于血液細胞、神經細胞、肌肉細胞等具備替代和修復死亡和受損傷的細胞、免疫調節、激活休眠和處于抑制狀態的細胞等作用，并可通過旁分泌作用，分泌多種生物活性因子，促進細胞增殖和抑制細胞凋亡。干細胞的這些功能使其在醫學研究和治療中具有巨大的潛力，特別是在組織修復、再生醫學和免疫調節等領域。簡單總結下干細胞的作用，就是“4R”，即repair（修復）、replace（取代）、restore（恢復）、regenerate（再生）。

目前用于細胞治療產品的干細胞主要有4種：1）人胚胎干細胞（human embryonic stem cells, hESCs）；2）誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）；3）成體干細胞（adult stem cells, ASCs）又稱組織特異性干細胞或成體多能干細胞；4）基因編輯干細胞（gene-editing stem cells, GSCs）。hESCs是一種具有極高分化潛能的細胞，它們來源于早期胚胎（通常是受精卵發育到囊胚階段的內細胞團）。hESCs具有發育全能性，理論上可以分化為成人體內的任何一種細胞類型。iPSCs是一種通過特定方法將成熟體細胞重新編程為具有多能性狀態的干細胞。通過向成熟體細胞（如皮膚細胞或血液細胞）中引入特定的轉錄因子（如Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc），可以將這些細胞轉化為iPSCs。iPSCs具有與胚胎干細胞類似的多能性，能夠分化成體內幾乎所有類型的細胞。與胚胎干細胞相比，iPSCs的獲取不涉及破壞胚胎，因此在倫理上更具優勢。ASCs存在于成熟動物的許多組織中，負責維持和修復組織。通常與它們所在的組織或器官具有相同的特性，例如，造血干細胞主要存在于骨髓中，負責生成血細胞。與胚胎干細胞相比，成體干細胞的分化潛能通常有限。它們主要分化為所在組織的特定細胞類型，但某些成體干細胞也顯示出跨系分化的潛力。GSCs是指利用基因編輯技術對干細胞的基因組進行精確修改的細胞。這種技術允許科學家在分子水平上改變或修復特定基因，以研究基因功能、治療遺傳性疾病或提高干細胞的醫學應用潛力。

干細胞因其可自我更新、多向分化及旁分泌影響其它細胞群等特點，為非臨床研究帶來了很多挑戰，結合公開文獻和指導原則做下梳理。

干細胞產品的非臨床評價需要回答以下幾個核心問題。用于動物試驗的干細胞，要進行充分的表征，包括但不限于細胞鑒定、純度、活力、無菌和穩定性等。之后再通過動物模型、生物分布、毒理和成瘤性試驗逐步表征干細胞的藥理學和毒理學特點。

之所以要回答以上問題，很大程度上與干細胞這類產品的特點相關。所有的安全性風險來自于干細胞的增殖和分化特性。增殖和分化均有成瘤風險。一是有些增殖不可控，可能成瘤。二是有些非預期的分化會形成異位組織。最終分化的細胞（intended cell type）可能會進一步發育成熟后通過多種作用機制發揮作用，需要研究清楚。干細胞也有可能移行到遠端組織，引起毒性。另外一個風險則是免疫原性，風險可能來自干細胞本身，也可能來自基因修飾的表達產物，涉及到免疫系統對受試干細胞的反應。非臨床安全性研究很大程度上就為了評估這些風險。

GLP依從性

原則上非臨床安評應遵循GLP。如果是藥效或生物分布中伴隨安全性終點，也應最大限度按照GLP要求執行。

相關種屬選擇

首先，干細胞產品非臨床研究沒有默認種屬，能提供所選擇種屬的科學依據即可。所選擇的種屬需是藥理學敏感種屬，即動物對人源干細胞及其分化后細胞的生物學反應與預期人體反應類似。為滿足常規研究周期需要，動物要有3-12個月正常壽命。另外，動物試驗系統需要是“progressive host”，允許細胞正常生存。FDA建議先在目標種屬上開展預試驗，看下接種細胞的生存情況。尤其擬采用免疫健全動物開展實驗，如果免疫排斥明顯，細胞不能正常長期存活，不適合在該種屬開展正式毒理研究。

另外，所選動物盡量能滿足相同的臨床擬用裝置和給藥路徑。大鼠（包括新生動物）、小鼠、非人靈長類、豬、手術動物、免疫缺陷動物模型等均有使用經驗。大、小動物各有優劣，說不上誰好誰壞，大動物生理學和解剖結構與人體更為接近，方便采用臨床擬用裝置將藥物遞送到理想位置，并能保障充分的遞送劑量。小動物則數量可以更多、更容易進行基因編輯，且有大量現成的免疫缺陷動物可用。

相比于健康動物，免疫缺陷動物潛在可減少免疫排斥，即免疫耐受性表現更好。免疫缺陷動物可以是先天缺陷，也可以給予免疫健全動物免疫抑制藥物實現。免疫缺陷和免疫抑制動物模型也是各有優劣，如下表所示。

動物疾病模型有助于活性-毒性和風險-獲益比的評估，也是推薦采用的。但動物疾病模型也是有優缺點的。優點包括：1）可以在病理生理狀態下的局部微環境中評價產品的安全性；2）可以同時評估劑量/活性和劑量/毒性關系；3）鑒定潛在可用于指導臨床的有效性和風險因素的biomarkers。缺點則包括：1）個體間變異大；2）缺乏可靠的歷史背景數據和基線數據；3）潛在需要給予免疫抑制劑；4）動物護理問題和動物倫理問題。

其它因素如解剖學角度的器官和組織大小，是否允許使用靶向遞送裝置完成人體劑量遞送，自體細胞的可獲得性等也需要在種屬選擇過程中予以考慮。比如，用于人眼的RPE干細胞植入物體積較大，因此與人類眼睛大小相似的動物（如豬），是最合適的動物模型。

如果對干細胞進行了基因修飾，則被改造目的基因及其表達產物的種屬相關性也需要考慮。

供試品

首選的自然是臨床擬用產品?？梢栽诿庖呷毕輨游锘蛘呙庖咭种苿游镏虚_展。還有些干細胞在免疫健全動物中也可以開展非臨床研究，因為有些接種位置是免疫豁免的（Immune privileged），或者有些細胞具備免疫豁免特點，不會被動物免疫系統排斥。

如果無法采用臨床擬用產品，也可以考慮動物源替代產品，但要求比較高，無論生產工藝還是影響有效性和安全性的關鍵質量參數，均需要與人源產品進行比對。動物源產品的挑戰包括可能產生與人源干細胞不同的生物學作用、缺少表征動物源干細胞的試劑、潛在產生不同的雜質。而且，不同種屬間來源的干細胞之間的相似性研究尚不充分，缺乏統一的相似性評價標準。這類產品獲得的數據，臨床轉化存在一定的不確定性。

另外，干細胞的包材和生物支持性材料的選擇和表征，也很關鍵。

藥理學研究

與其它傳統藥物藥理學研究邏輯類似，也是分為體內和體外兩部分，體外重點考察干細胞的表型和功能，如增殖、分化、分泌等能力，以及可能的基因改造引入的功能變化。比如有神經營養作用的干細胞需考察對細胞死亡的保護作用和/或分化成神經元的能力。對于潛在血管生成活性的內皮細胞，則要考察誘導產生血管結構的能力。體內則需要論證模型構建的科學性和合理性，并盡可能選擇人體疾病相關動物模型開展。

藥代動力學

在相關動物種屬中考察干細胞藥代行為，如生物分布、遷移、定植、增殖、分化、存續性等。生物分布可伴隨藥效學試驗中考察。如果涉及基因修飾，對目的基因的存續、表達等也需要研究。

安全藥理學

可結合在一般毒理學研究中進行。是否需要開展補充和追加的安全藥理學研究，則視產品風險和情況而定，與其它藥物的開展原則類似。

一般毒理學

種屬

相關種屬選擇依據前文已有介紹。毒理試驗原則上采用兩種動物開展。如采用一種動物，需要提供科學合理性依據。通常采用雙性別動物開展，如采用單一性別，也需要說明合理性。

劑量設計

同其他類型藥物，一般設置多個劑量，如低、中、高三個劑量。高劑量可以藥效學最高劑量的一定倍數、臨床最高劑量的一定倍數或最大可行劑量。低和中劑量則在高劑量基礎上設置合理劑間距確定。

試驗設計

動物給藥場景盡可能模擬臨床，與臨床用藥場景盡可能接近（Mimic clinical scenario as closely as possible），包括細胞活力、濃度、制劑、體積、遞送速率、植入或注射部位、植入或注射數量、遞送系統、遞送時間節點、遞送方案、給藥途徑等。除了給藥組和陰性對照組，可根據情況設置假手術組。

試驗周期的長度取決于干細胞產品的體內存續時間和受試動物的壽命，短則4-12周，長則3-12個月。根據干細胞作用時間長短和給藥次數，動物處理時間點一般設置為多點，可以分為時間點1（給藥后48h或1周）、時間2（給藥后2周或3個月）、時間點3（給藥后3-4周或6個月）。

生物分布和毒理學方案簡單設計如下表所示。有效性研究可以合并到毒理試驗中。

Q-PCR可以用于非靶組織分布的初篩，以減少IHC技術篩選非靶組織的需求。Q-PCR陽性的組織，可以再用IHC或者其它技術確認。通常干細胞毒理試驗會設置多個動物處死時間點，考察急性、慢性和/或延遲毒性，及可能的毒性恢復情況。前序時間點，Q-PCR檢測陰性，有助于減少后續時間點待檢組織數量。如果對照組沒有注射細胞，可以適當調整對照組組織收集的清單，僅采集必要組織。

檢測方法

干細胞生物學作用比較復雜，對檢測方法的要求很高。無論在人體還是動物模型中，經常會發現移植后干細胞的大量死亡，成功分化的數量比較有限。傳統的病理HE染色可以檢測到組織內數量比較多的干細胞，如果數量很少，HE就不那么適用了。這種情況下，需要對干細胞的作用機理有深入了解，干細胞發揮功能是通過直接發揮作用如組織再生，還是通過激活內源性干細胞或祖細胞發揮作用?？梢酝ㄟ^一些biomarkers，采用諸如IHC、PCR、ISH的方法進行特異性評估。比如人源干細胞移植到動物體內，可以通過檢測人核抗原、線粒體抗原監測人源成分。細胞增殖則可以通過增殖細胞核抗原（PCNA）或Ki67進行檢測。

細胞支架

干細胞的制劑處方與傳統生物藥物也不同，為維持干細胞再生能力，制劑中通常會加入3D可生物降解支架、“支持性細胞”和/或其他生物活性分子，如骨形態發生蛋白（BMP）。多細胞混合組分使得安評更加復雜化，比如移植物抗宿主反應、支架材料的生物相容性、免疫原性等，需要重點關注。

試驗終點

標準的安全性終點包括死亡率、臨床觀察、體重、體格檢查、攝食量、飲水、臨床病理（血生化、血液學、凝血、尿液分析）、器官重量、大體解剖和組織病理學檢查等?；九c其它藥物一般毒理學研究終點類似。

不過，干細胞由于不能被完全清除，一般不需要設置恢復期動物，但需要觀察足夠長時間，以評估慢性和脫靶毒性。

組織收集

與傳統生物藥物不同，病理學家在干細胞毒理評價中的作用尤為關鍵，不僅限于干細胞可能引起的毒理學變化，還可以通過評價干細胞形態、干細胞特定的表面抗原或可用于鑒別該細胞的biomarkers等，確定干細胞的組織分布、存續時間等。

干細胞給藥部位（route of administration, ROA）和附近的引流淋巴結與藥效和安全性最相關。其次則是與給藥部位直接相連接的組織。另外，血供最豐富的器官如肝臟、脾臟和肺也需要重點評價，可以評估干細胞隨血液的移行擴散。再就是一些非正常的瘤塊可能與干細胞的成瘤性相關。所以干細胞的組織病理評價可以根據風險進行分級，如下表示例。

成瘤性和致瘤性

未分化的干細胞有增殖上調的風險，可以分化或去分化成畸胎瘤或其它腫瘤，故成瘤性是干細胞產品的一個重要安全性風險。最好找到合適的biomarkers界定腫瘤是否來自人源干細胞。多能干細胞（如iPSCs和ESCs）的成瘤風險高于成體干細胞（如間充質干細胞、造血干細胞等）。

致瘤性風險指干細胞終產品促使正常細胞轉變為腫瘤細胞的可能性。

對于成瘤性和致瘤性風險較低的成體干細胞產品，通常應在首次臨床試驗前至少完成體外成瘤性評價；對于擬用于非晚期腫瘤適應癥且風險較低的干細胞產品，通常在上市前完成體內成瘤性和/或致瘤性試驗。

對于成瘤性和/或致瘤性風險較高的干細胞產品（例如多能干細胞產品、其他分化程度較低的干細胞產品、藥學和/或已有非臨床研究提示風險較高的產品等），在首次臨床試驗前，應完成體外成瘤性評價、臨床給藥途徑或敏感給藥途徑（如皮下注射、睪丸注射、肌腱注射、脊髓內注射等，應有合理依據）的體內成瘤性試驗；若成瘤性試驗出現陽性結果，或者一般毒理學試驗中發現受者來源的癌前病變、可疑癌變等，首次臨床試驗前還應完成臨床給藥途徑的致瘤性試驗。若成瘤性試驗結果為陰性，上市前完成臨床給藥途徑的致瘤性試驗。

遺傳毒性

不需要開展標準組合的遺傳毒性試驗。如果設計基因修飾，需進行基因插入突變、基因編輯脫靶等風險評估。

免疫原性和免疫毒性、生殖毒性、制劑安全性

與其它藥物類似，常規開展。免疫原性要考慮到動物是免疫缺陷動物還是免疫健全動物，根據產品特性和風險，考慮是否開展。如果涉及基因修飾，表達的目標蛋白的免疫原性也需要評價。

其它

FDA認為，干細胞試驗可以考慮將POC+Tox+cell fate整合在一個動物模型中開展，更符合動物“3R”原則。Cell fate指的是細胞的存活、分化/表型、去分化、遷移、異位組織形成、增殖等變化。