Cell Death Differ (IF=15.4) I 武漢大學鄭凌教授團隊揭示肝臟GAPDH通過絲氨酸依賴性抑制二酰甘油合成，防止空腹引起的過度脂肪變

2026年3月17日，武漢大學生物系鄭凌教授團隊在Cell Death Differ (IF=15.4，中科院1區(qū)，Q1，TOP期刊)在線發(fā)表題為“Hepatic GAPDH prevents excessive fasting-induced steatosis via serine-dependent inhibition of diacylglycerol synthesis”（肝臟GAPDH通過絲氨酸依賴性抑制二酰甘油合成，防止空腹引起的過度脂肪變）的研究論文。

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【摘要】

禁食誘導的代謝重塑是維持系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的基本過程，對代謝疾病干預具有深遠影響。在空腹期間，肝臟建立一個以糖新生為中心的調(diào)控網(wǎng)絡，整合主要燃料以維持生理能量的穩(wěn)態(tài)。本文報告，GAPDH作為糖酵解和糖新生的關(guān)鍵酶，能夠感知肝臟的空腹應激。與野生型對照相比，肝細胞Gapdh缺乏癥（Gap白色小鼠在夜間空腹后，血糖、氨基酸水平下降以及肝臟脂質(zhì)積累加重，表現(xiàn)相當。機制上，Gapdh的耗竭降低絲氨酸水平，絲氨酸補充通過下調(diào)脂蛋白1（DAG合成中的一種磷水解酶）來抑制PA-DAG（磷酸-二酰甘油）軸。此外，敲低Lipin1挽救了空腹間隙中觀察到的效應白色老鼠。同樣，Gap白色小鼠在生酮飲食下肝脂積累增強，絲氨酸補充消除了這些影響。我們共同發(fā)現(xiàn)，肝臟GAPDH在營養(yǎng)限制期間是葡萄糖-氨基酸-脂肪代謝的核心樞紐。

01

研究背景及科學問題

禁食和進食是一種內(nèi)源性生物節(jié)律，協(xié)調(diào)每日生理周期[1]。由于食物攝入限制導致的細胞反應改變被稱為“空腹生理”[2]。近年來，禁食或模仿禁食的飲食受到關(guān)注，因為它們可能作為肥胖、糖尿病、癲癇和癌癥的有效干預，具有提升胰島素敏感性、減少炎癥和促進細胞修復的潛在優(yōu)勢[3， 4]。然而，禁食可能會加重虛弱個體的營養(yǎng)缺乏，即使是健康成年人[5]。因此，了解禁食期間強健且復雜的代謝變化（這些變化尚未完全明了），將確保禁食或模擬飲食的安全應用，并推動有效的治療實施。

肝臟在協(xié)調(diào)空腹-進食過渡中起著關(guān)鍵作用，通過調(diào)節(jié)肝臟的葡萄糖、脂肪和氨基酸代謝，維持生理能量和血糖的穩(wěn)態(tài)[6]。在禁食和長期饑餓期間，肝細胞會發(fā)生多方面的代謝重編程，包括1）葡萄糖通量的再利用，從糖酵解轉(zhuǎn)化為通過糖原分解（短期）和糖新生（長期）產(chǎn)生葡萄糖[6]。2）優(yōu)先提升脂質(zhì)氧化，游離脂肪酸（FFAs）成為生成ATP和酮體的主要燃料[7]。或者被酯化成甘油三酯（TGs），并儲存在脂滴（LDs）中，稱為空腹誘導脂肪變[8]。3）動員氨基酸儲備，蛋白水解來源的氨基酸要么作為糖新生前體，要么進入三羧酸循環(huán)進行無乳反應[6]。協(xié)調(diào)這些相互依賴的代謝重塑過程的具體機制仍未完全明了。

作為一項能量要求極高的過程，糖新生需要凈ATP/GTP水解以克服熱力學障礙。ATP/GTP依賴的糖新生途徑包括四種獨特的催化不可逆反應酶，以及六種與糖解催化可逆反應共享的酶[9]。肝缺乏葡萄糖-6-磷酸酶（G6pc）或果糖雙磷酸酶1（Fbp1）若催化不可逆反應而不消耗ATP/GTP，則小鼠空腹血糖水平顯著降低[10， 11]。然而，在小鼠中，催化ATP/GTP不可逆反應的磷烯醇丙酮酸羧激酶1（Pck1）或丙酮酸羧化酶（Pc）的肝缺乏，其空腹血糖水平與野生型相當[12， 13]。盡管這兩種酶對血糖水平的影響不同，肝臟中四種獨特酶中的任一缺乏會伴隨空腹期間肝脂肪變加劇[10,11,12,14]。表明肝臟糖新生損傷導致葡萄糖和脂質(zhì)通路之間的代謝重編程。然而，催化可逆反應的酶是否也參與能量穩(wěn)態(tài)和禁食期間血糖穩(wěn)定性，目前尚不清楚。

甘油醛3-磷酸脫氫酶（GAPDH）催化糖新生和糖酵解中能量消耗和非能量消耗過程的可逆反應，是葡萄糖代謝中的強有力調(diào)節(jié)劑[15]。此外，GAPDH還是一種兼職蛋白，具有多重功能，包括抑制細胞內(nèi)囊泡運輸以維持細胞能量穩(wěn)態(tài)[16]。并參與DNA損傷修復[17]。因此，它們在神經(jīng)退行性疾病和腫瘤發(fā)生中起著重要作用。盡管對GAPDH在壓力適應和疾病中的多方面作用已有數(shù)十年研究，其在正常生理中的基本功能仍然令人費解。

在此，我們生成了肝細胞特異性Gapdh敲除（Gap白色）小鼠，并研究了其在任意情況下的效果，包括禁食和生酮飲食的進食條件。與野生型對照相比，差距白色小鼠在夜間禁食時，血糖表現(xiàn)相當，且通過增加PA-DAG（磷酸-二酰甘油）軸線，加重肝脂積累。通過廣泛靶向的代謝組學研究，我們發(fā)現(xiàn)白色小鼠將糖新生的底物從丙酮酸切換為甘油，以在禁食時維持血糖;與此同時，Gap中發(fā)現(xiàn)肝氨基酸水平下降，特別是絲氨酸和甘氨酸白色禁食和生酮飲食期間的老鼠。此外，絲氨酸補充或敲低Lipin1（DAG合成中的一種磷酸水解酶）挽救了Gap中的肝脂積累白色禁食和/或生酮飲食喂養(yǎng)時的小鼠。

02

重要發(fā)現(xiàn)及亮點

肝細胞Gapdh缺乏癥在空腹狀態(tài)下可導致肝腫大，且血糖水平與正常人相當。

鑒于糖酵解和糖異生分別是飽腹和禁食狀態(tài)下葡萄糖代謝的主要途徑，我們首先檢測了自由攝食和兩種禁食條件（16 小時過夜禁食和 32 小時長期禁食）下肝臟中 GAPDH（一種在兩種途徑中均起關(guān)鍵作用的雙向酶）的表達動態(tài)。Gapdh 的 mRNA 水平未發(fā)生改變（圖 1A），然而，其蛋白水平升高，并在禁食 32 小時后于門靜脈區(qū)域富集（圖 1B、C）。全身Gapdh敲除小鼠會導致胚胎致死 [ 18 ]。因此，為了研究肝臟 GAPDH 的生理效應，我們構(gòu)建了肝細胞特異性Gapdh敲除（Gap Alb）小鼠，并以同窩Gap fl小鼠作為野生型（WT）對照（補充圖 1）。盡管Gap Alb小鼠與Gap fl小鼠的呼吸交換率（RER）無差異，但在48小時的監(jiān)測中，禁食24小時后，Gap Alb小鼠的耗氧量、二氧化碳排出量和能量消耗（EE）均顯著降低（圖 1D、E和補充圖 2 ），而自由攝食條件下Gap fl小鼠和Gap Alb小鼠之間無差異（補充圖 3A-D）。為了研究肝細胞中Gapdh缺失引起的不同禁食階段的代謝變化，我們分別讓小鼠禁食16小時（EE無顯著變化）或32小時（EE顯著變化）。

圖 1：肝細胞Gapdh缺乏癥在空腹時引起肝腫大，血糖水平相當。

A、B： C57小鼠禁食后指定時間點肝臟Gapdh mRNA（A）和蛋白（B ）的相對水平（每組?mRNA n =6，?蛋白n =3）。C ：野生型小鼠禁食后指定時間點肝臟切片上Gapdh（綠色）與精氨酸琥珀酸裂解酶（Asl，紅色）和谷氨酰胺酶（Gls，藍色）共染色的代表性圖片，并分析Gapdh熒光強度（?每組n =3），圖像以相同放大倍數(shù)拍攝。DE： Gap fl和Gap Alb小鼠禁食48小時期間的能量消耗（EE）曲線（D）及定量數(shù)據(jù)（E） （?每組n =6）。FH ：Gap fl和Gap Alb小鼠禁食后指定時間點的體重（BW，F(xiàn)）、體重變化（G）和血糖水平（H） （?每組n =6）。圖I為Gap fl和Gap Alb小鼠禁食后指定時間點的代表性解剖圖像，圖J和圖K分別顯示了肝臟重量與體重的比值（?每組n = 6）。Ad表示自由采食；F16 和 F32 分別表示禁食 16 小時和 32 小時。*P ?< 0.05，**P ?< 0.01；數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（A - C）和雙因素方差分析進行分析。

與Gap fl小鼠相比，Gap Alb小鼠在禁食 32 小時后體重下降較少，但在禁食 16 小時后體重下降較少（圖 1F、G）。然而，Gap Alb小鼠在自由攝食和兩個禁食時間點的 血糖水平與Gap fl小鼠相當（圖1H ）。進一步的解剖學分析顯示，與禁食的Gap fl小鼠相比，禁食的Gap Alb 小鼠肝臟增大且顏色變淺，肝臟重量與體重的比值顯著增加（圖 1I、J）。除了肝臟外，腎臟也是禁食期間糖異生的重要器官[ 19 ]。禁食 16 小時后， Gap Alb和Gap fl小鼠的腎臟重量與體重的比值均增加（圖 1K）。同時，6-12 周齡的 Gap Alb和Gap fl小鼠在自由攝食條件下表現(xiàn)出相似的體重、食物攝入量、脂肪/瘦體重（補充圖3E-G），表明在正常條件下，肝細胞Gapdh缺失不影響生長和能量消耗，具有耐受性。

禁食的Gap Alb小鼠的血糖水平通過甘油生成的糖異生作用而保持穩(wěn)定。

出乎意料的是，在生理禁食和長期禁食條件下， Gap Alb和Gap fl小鼠的血糖水平相當（圖 1H）。然而，在短期禁食（4 小時）下，Gap Alb小鼠的血糖水平迅速下降，而Gap fl小鼠的血糖水平與自由采食條件下的血糖水平相當（圖 2A）。此外，在另一組 16 小時禁食實驗中， Gap fl和Gap Alb小鼠的血糖水平也相似，但與相應的自由采食條件相比顯著降低（圖 2A）。這些結(jié)果表明，盡管肝細胞Gapdh缺陷在禁食早期會損害血糖水平，但機體會迅速適應其他機制來穩(wěn)定血糖水平。

圖 2：禁食肝細胞Gapdh缺陷小鼠的穩(wěn)定血糖水平是由甘油糖異生驅(qū)動的。

A.禁食后指定時間點Gap fl和Gap Alb小鼠的血糖水平（Ad 組（自由采食）、F4 組（禁食 4 小時）和 F16 組（禁食 16 小時）每組n ?= 6、4 或 6 ）。B 、C .禁食后指定時間點Gap fl和Gap Alb小鼠肝臟的過碘酸-雪夫氏-蘇木精 (PASH) 染色 ( B ) 和糖原水平 ( C ) 的代表性圖片（Ad 組、F4 組和 F6 組每組n ?= 6、4 和 6），( B ) 中的圖像以相同的放大倍數(shù)拍攝。D .禁食 16 小時后Gap fl和Gap Alb小鼠肝臟糖異生相關(guān)代謝物的相對熱圖； P值標注在右側(cè)（?每組n = 4）。 E – G禁食16小時后，Gap fl和Gap Alb小鼠血清（E）和肝臟（F、G）中指定代謝物的峰面積（?血清或肝臟檢測每組n =6或4） 。H禁食0、4或16小時后， Gap fl和Gap Alb小鼠血清甘油水平（ Ad、 F4或F16條件下每組n ?=5、4或6 ）。I 、J禁食16小時后， Gap fl和Gap Alb小鼠肝臟甘油激酶（Gk）和甘油-3-磷酸脫氫酶1（Gpd1）的相對mRNA（I）和蛋白（J ）水平（?每組n =6）。 K、L：在禁食3小時后，用丙酮酸（K）或甘油（L）刺激原代小鼠肝細胞培養(yǎng)基中葡萄糖水平（每組n=3）。M、N：Gap ?fl 和Gap Alb 小鼠禁食16小時后的丙酮酸耐受試驗（PTT，M）和甘油耐受試驗（GlyTT，N） （?每組n =4）。 *P ?<0.05，**P <0.001。 ?< 0.01；數(shù)據(jù)采用雙因素方差分析（A、C）和學生 t 檢驗進行分析。

在短期禁食階段（通常為餐后數(shù)小時），血糖水平最初由肝糖原分解維持，直至糖原耗竭，隨后逐漸由肝糖異生接管[ 20 ]。因此，我們首先檢測了Gap fl和Gap Alb小鼠的肝糖原水平。在自由攝食條件下，兩組小鼠的肝糖原水平相似，但禁食4小時后，兩組小鼠的肝糖原均已耗竭，PASH（過碘酸-雪夫氏染色和蘇木精染色）染色和糖原測定結(jié)果均證實了這一點（圖 2B、C） ，表明糖原分解可能并非導致Gap fl和Gap Alb小鼠血糖水平差異的原因。盡管禁食會導致胰高血糖素迅速升高以促進糖異生，但Gap fl和Gap Alb小鼠的血清胰高血糖素水平并無差異（補充圖 4A）。

接下來，我們對隔夜禁食的Gap fl和Gap Alb小鼠進行了廣泛的靶向代謝組學研究，以評估參與糖異生的代謝物（補充圖 4B ）。除GapAlb小鼠肝臟中葡萄糖-6-磷酸水平降低外，其他與糖異生相關(guān)的代謝物在兩組小鼠中相似（圖2D）。我們發(fā)現(xiàn)Gap fl 和Gap Alb 小鼠血清和肝臟中乳酸、丙氨酸、谷氨酰胺和丙酮酸的水平相似，這些通常是參與丙酮酸糖異生的底物[ 21 ] （圖 2E、F）。然而，我們發(fā)現(xiàn)Gap Alb小鼠肝臟中甘油-3-磷酸（Gro-3-P，甘油糖異生途徑的第一個產(chǎn)物）的含量顯著降低（圖 2G ），而隔夜禁食后血清甘油水平顯著升高，但在禁食4小時或自由攝食條件下未觀察到此現(xiàn)象（圖 2H）。這表明，肝臟甘油糖異生的增強可能有助于隔夜禁食的Gap Alb小鼠血糖穩(wěn)定。與此一致的是，Gap Alb小鼠肝臟中兩種與甘油糖異生相關(guān)的酶——甘油激酶（Gk）和甘油-3-磷酸脫氫酶1（Gpd1）的mRNA和蛋白水平顯著升高（圖 2I、J）。同時，與Gap fl小鼠相比， Gap Alb 小鼠肝臟中丙酮酸糖異生限速酶的 mRNA 水平相似，但Pc水平降低（補充圖 4C ）；然而， Gap Alb小鼠肝臟中 Fbp1 和 Pck1 的蛋白質(zhì)水平顯著升高，而 G6pc 和 Pc 水平不變（補充圖 4D）。

甘油不僅是禁食期間糖異生作用的底物，也是脂肪組織脂解的主要產(chǎn)物。因此，我們檢測了附睪白色脂肪組織（eWAT）的形態(tài)和脂解相關(guān)基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，禁食16小時的Gap Alb小鼠eWAT中eWAT與體重的比值降低，脂肪細胞體積減小，脂解基因Pnpla2（含patatin樣磷脂酶結(jié)構(gòu)域2）和Hsl（激素敏感性脂肪酶）的mRNA水平升高（補充圖4E -I）。因此，我們利用RNA測序結(jié)果（禁食16小時的Gap Alb和Gap fl小鼠肝臟轉(zhuǎn)錄組）結(jié)合SEPDB、MDSEC和SPOCTOPUS三個分泌蛋白數(shù)據(jù)庫，搜索潛在的肝臟因子（補充圖 4J）。利用UniProt數(shù)據(jù)庫對32個重疊的改變的肝因子進行進一步分析，鑒定出Clstn3b（鈣結(jié)合蛋白3）、Inhbb（抑制素β-B）、Serpina12（絲氨酸（或半胱氨酸）肽酶抑制劑，A類成員12）和Obp2a（氣味結(jié)合蛋白2A）這四個參與脂質(zhì)代謝過程的基因，并通過qPCR進一步驗證（補充圖 4K、L）。該發(fā)現(xiàn)提示肝細胞Gapdh缺失可能通過肝因子影響脂肪組織的脂肪分解。

為了評估肝細胞中Gapdh缺陷后利用丙酮酸或甘油進行糖異生的能力，我們進行了體外和體內(nèi)丙酮酸耐量試驗 (PTT) 和甘油耐量試驗 (GlyTT)。將小鼠原代肝細胞預先用無葡萄糖培養(yǎng)基處理 3 或 12 小時，以模擬體內(nèi)短期或長期禁食。在從Gap fl 小鼠分離的原代肝細胞中觀察到丙酮酸處理后葡萄糖生成逐漸增加，而在從Gap Alb小鼠分離的原代肝細胞中未觀察到葡萄糖生成（圖 2K和補充圖 4M ）。相反，在從Gap fl或Gap Alb小鼠分離的原代肝細胞中均觀察到甘油處理后葡萄糖生成逐漸增加。出乎意料的是，在Gap Alb小鼠的肝細胞中，長期（而非短期）體外禁食后葡萄糖生成增加（圖 2L和補充圖4N）。與此一致的是，盡管Gap fl小鼠注射丙酮酸后血糖水平迅速升高并在60分鐘達到峰值，但在注射丙酮酸的Gap Alb小鼠中，120分鐘PTT期間血糖水平僅輕微升高（圖 2M ）。同時，兩組小鼠注射甘油后血糖水平均迅速升高，且在120分鐘GlyTT期間葡萄糖生成能力相似，然而，在Gap Alb小鼠中，最初30分鐘的甘油糖異生水平顯著降低（圖 2N）。

肝細胞Gapdh缺乏會促進禁食小鼠肝臟甘油三酯水平升高。

H&E 和油紅 O 染色顯示，禁食的Gap fl和Gap Alb小鼠肝臟中存在大量空泡以及 LD 染色區(qū)域增多，且在隔夜或長期禁食的 Gap Alb小鼠肝臟中更為明顯（圖3A-C）。與此一致的是，禁食的Gap Alb小鼠肝臟甘油三酯 (TG) 水平升高，即使禁食 4 小時后也是如此（圖 3D和補充圖 5A ）。Gap Alb小鼠血清 TG 水平僅在禁食 16 小時后升高，其他禁食時間點未見升高（圖 3E和補充圖 5B ）。隔夜或長期禁食的 Gap Alb 和 Gap fl 小鼠 血清游離脂肪酸( FFA )水平相似（圖3F）。由于肝臟中的游離脂肪酸在禁食期間被氧化生成酮體并釋放到血液中，作為其他組織的燃料[ 22 ]，我們檢測了血清酮體水平，發(fā)現(xiàn)禁食16小時的Gap Alb小鼠血清β-羥基丁酸水平顯著降低（補充圖 5C、D）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，禁食期間肝臟Gapdh缺乏會導致脂質(zhì)代謝紊亂。

圖 3：肝細胞Gapdh缺乏促進禁食小鼠肝臟甘油三酯水平升高。

A - C：代表性的H&E染色（A）、油紅O染色（B）及其定量結(jié)果（C ），分別顯示Gap fl和Gap Alb小鼠在禁食后指定時間點的肝臟組織?（每組n =6），各圖均以相同放大倍數(shù)拍攝。D ：Gap fl 和Gap Alb小鼠在禁食后指定時間點的肝臟甘油三酯（TG）水平（?每組n =6）。E 、F ： Gap fl 和Gap Alb小鼠在禁食后指定時間點的血清TG（E）和游離脂肪酸（FFA，F(xiàn)）水平（E，每組n = 6 ； F ?，Ad組（自由?采食）和F32組（禁食32小時）分別為每組n ?=6 ；F16組（禁食16小時）的Gap fl和Gap Alb小鼠分別為n=6和5）。G - L禁食16小時后，Gap fl和Gap Alb小鼠肝臟中脂肪分解（G）、甘油三酯合成（H）、游離脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白（ I）、脂肪生成（J）、脂肪酸結(jié)合蛋白（K ）和脂肪酸β-氧化（L ）相關(guān)基因的mRNA水平（?每組n =6）。 *P ?<0.05，**P ?<0.01；數(shù)據(jù)采用雙因素方差分析（C - F）或Student's t檢驗（G - L）進行分析。

接下來，我們研究了禁食的Gap Alb小鼠肝臟脂質(zhì)蓄積增加的原因。我們檢測了禁食16小時后主要脂肪分解酶的mRNA水平。與禁食的Gap fl小鼠相比，禁食的Gap Alb小鼠肝臟中Lipa和Lipc（脂肪酶A和C）、Mgll（單甘油酯脂肪酶）的表達顯著下調(diào)，而Pnpla2和Hsl的表達顯著上調(diào)（圖 3G）。對于甘油三酯合成酶，禁食的Gap Alb小鼠肝臟中Gpam（甘油-3-磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶）、Gpat3（甘油-3-磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶3）、Agpat2（酰基甘油-3-磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶2）、Lipin1、Lipin2和Dgat1 （二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶1）的表達顯著上調(diào)（圖 3H）。這些結(jié)果表明，禁食的Gap Alb小鼠肝臟中 TG 的利用減少和合成增加導致了肝臟脂質(zhì)的積累。

我們還評估了FFA轉(zhuǎn)運蛋白的mRNA水平。與禁食的Gap fl小鼠相比，禁食的Gap Alb小鼠肝臟中Cd36和Slc27a1（溶質(zhì)載體家族27成員1）顯著上調(diào)，而Slc27a2 / 5則略有下調(diào)（圖 3I）。為了追蹤FFA的攝取及其在脂滴中的摻入，我們用BODIPY標記的脂肪酸（C12和C16）處理原代小鼠肝細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Gap Alb小鼠原代肝細胞中FFA的攝取和脂滴摻入均增強（補充圖 5E-H）。

與Gap fl小鼠相比，編碼脂肪生成、脂肪酸結(jié)合蛋白和β-氧化的基因，如Fabp1 / 2（脂肪酸結(jié)合蛋白1/2）、Cpt1a（肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1A）、Acadm（酰基輔酶A脫氫酶中鏈）和Acat1 / 2 （乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶1/2），在禁食的Gap Alb小鼠肝臟中表達下調(diào)（圖 3J-L）。這些結(jié)果表明，游離脂肪酸（FFA）攝取增加和利用減少也導致了禁食Gap Alb小鼠肝臟脂質(zhì)的積累。與此一致的是，禁食Gap Alb小鼠肝臟中乙酰輔酶A的水平顯著降低（補充圖 5I）。

肝細胞GAPDH缺陷會降低禁食小鼠體內(nèi)絲氨酸和甘氨酸的水平及其分解代謝。

為了客觀地探究禁食16小時的Gap Alb小鼠肝臟中代謝通路的變化，我們利用廣泛靶向的代謝組學方法分析了差異代謝物。與Gap fl小鼠相比，Gap Alb小鼠表現(xiàn)出128種顯著改變的代謝物。KEGG分析顯示，在前10條通路中，有3條與氨基酸代謝相關(guān)，包括精氨酸和脯氨酸代謝、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝以及半胱氨酸和蛋氨酸代謝（圖 4A）。根據(jù)log2 FC值（Gap Alb vs. Gap fl）對代謝物水平進行排序，進一步表明絲氨酸 、天冬酰胺和甘氨酸是禁食Gap Alb小鼠肝臟中下調(diào)最顯著的氨基酸（圖 4B）。由于絲氨酸和甘氨酸可以相互轉(zhuǎn)化[ 23 ]，我們推測它們可能在禁食期間由Gapdh缺陷引起的代謝重編程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

圖 4：肝細胞Gapdh缺乏會降低禁食小鼠肝臟中的絲氨酸和甘氨酸水平。

A.禁食16小時后，Gap Alb 小鼠與Gap fl小鼠肝臟中差異代謝物富集的10條KEGG通路（?每組n =4）。B .禁食16小時后， Gap Alb小鼠與Gap fl小鼠肝臟氨基酸水平的log2倍數(shù)變化排名。C 、D.禁食16小時后，Gap fl小鼠和Gap Alb小鼠肝臟（C ）或血清（D）中絲氨酸和甘氨酸的水平（?每組n =6）。E 、F.禁食16小時后， Gap fl小鼠和Gap Alb小鼠肝臟中絲氨酸合成相關(guān)酶的mRNA（E）和蛋白（F ）水平（?每組n =6）。G .禁食16小時后， Gap fl小鼠和Gap Alb小鼠肝臟中Psat1染色的代表性圖像及其強度分析（?每組n =6）；圖像以相同放大倍數(shù)拍攝。 H.禁食16小時后，Gap fl和Gap Alb小鼠肝臟中3-磷酸絲氨酸的峰面積（?每組n =4）。I .使用[U-13C]-丙酮酸追蹤Gap fl和Gap Alb小鼠禁食16小時后肝臟中絲氨酸的合成，進行代謝通量分析（?每組n =4）。* P ?< 0.05，** P ?< 0.01；數(shù)據(jù)采用Student's t檢驗進行分析。

接下來，我們采用高效液相色譜法（HPLC）測定了絲氨酸和甘氨酸的水平。與代謝組學結(jié)果（圖 4B ）一致，禁食16小時后， Gap Alb小鼠肝臟和血清中的絲氨酸和甘氨酸水平顯著低于Gap fl小鼠（圖 4C、D）。肝臟中絲氨酸和甘氨酸的代謝涉及攝取、合成、降解和利用（補充圖 6A），我們首先研究了攝取過程。絲氨酸和甘氨酸均由中性氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白轉(zhuǎn)運，在禁食期間，肝臟中主要由SLC38A1（溶質(zhì)載體家族38成員1）、SLC38A2和SLC38A4介導[ 23 ]。在這些轉(zhuǎn)運蛋白中， Slc38a4的 mRNA 水平略有上調(diào)，而其蛋白質(zhì)水平在隔夜禁食的Gap Alb小鼠肝臟中沒有變化（補充圖 6B、C）。

接下來，我們分析了絲氨酸/甘氨酸合成途徑。在禁食16小時的Gap Alb小鼠中，肝臟Phgdh（磷酸甘油酸脫氫酶）和Psat1（磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶1）的mRNA水平上調(diào)，而Shmt2 （絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶2）的mRNA水平下調(diào)（圖 4E），但它們的蛋白水平?jīng)]有改變（圖 4F、G）。令人驚訝的是，從頭合成絲氨酸的底物3-磷酸絲氨酸顯著減少（圖 4H），表明絲氨酸合成受到抑制。

為了進一步研究Gapdh缺陷如何影響絲氨酸合成，我們使用 [U-13C]-丙酮酸（禁食期間絲氨酸合成的主要碳源 [ 24 ]）進行了碳示蹤分析。與Gap fl小鼠相比，禁食 16 小時的Gap Alb小鼠肝臟中 M + 3 標記的磷酸烯醇式丙酮酸、3-磷酸絲氨酸和絲氨酸的比值顯著降低（圖 4I）。該結(jié)果表明，禁食期間 GAPDH 的缺失會破壞肝臟中從磷酸羥基丙酮酸到絲氨酸的代謝通量。

我們進一步檢測了與絲氨酸/甘氨酸降解和利用相關(guān)的基因的mRNA水平。在禁食16小時的Gap Alb小鼠肝臟中，參與絲氨酸降解的Agxt（丙氨酸-乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶）、參與絲氨酸利用的Ptdss1（磷脂酰絲氨酸合成酶1）、參與甘氨酸降解的Gldc（甘氨酸脫羧酶）、Amt （氨甲基轉(zhuǎn)移酶）、 Gcsh （甘氨酸裂解系統(tǒng)蛋白H）以及參與甘氨酸利用的Sardh（肌氨酸脫氫酶）的表達均下調(diào)（補充圖 6D、E ）。這些結(jié)果表明，禁食的Gap Alb小鼠肝臟中絲氨酸/甘氨酸水平的降低導致了其利用率的下降。

補充絲氨酸可緩解禁食期間肝細胞Gapdh缺乏引起的肝腫大和脂質(zhì)蓄積。

為了探究絲氨酸或甘氨酸水平的改變是否會影響禁食Gap Alb小鼠的代謝重塑，我們在禁食期間給小鼠飲用水中添加了5%的絲氨酸或甘氨酸。由于絲氨酸和甘氨酸可以相互轉(zhuǎn)化，因此，補充絲氨酸或甘氨酸均能顯著且相互上調(diào)Gap fl和Gap Alb小鼠血清和肝臟中的絲氨酸和甘氨酸水平（圖 5A、B和補充圖 7A、B）。兩種氨基酸的補充均未影響Gap fl和Gap Alb小鼠的體重（補充圖 7C ）。補充絲氨酸顯著提高了禁食16小時的Gap fl小鼠的血糖水平，而甘氨酸的影響較小（圖 5C）。出乎意料的是，絲氨酸而非甘氨酸提高了禁食16小時的Gap Alb小鼠的血糖水平（圖 5C）。

圖 5：補充絲氨酸可緩解禁食期間肝細胞Gapdh缺乏引起的肝腫大和脂質(zhì)積累。

A、B：Gap fl和Gap Alb小鼠在禁食 16 小時后，補充或不補充絲氨酸/甘氨酸的情況下，肝臟絲氨酸 ( A ) 和甘氨酸 ( B ) 的水平（?每組n = 5）。C ：各組小鼠的血糖水平（?每組n = 5）。D ：各組小鼠的代表性肝臟解剖圖像。E ：肝臟重量與體重的比值（?每組n = 5）。F - G ： Gap fl和Gap Alb小鼠在禁食 16 小時后，補充或不補充絲氨酸/甘氨酸的情況下，肝臟PASH 染色 ( F ) 和糖原水平 ( G ) 的代表性圖像（?每組n = 5），( F ) 中的圖像以相同的放大倍數(shù)拍攝。H 、I：各組小鼠肝臟切片的代表性 H&E 染色 (H) 和油紅 O 染色及定量結(jié)果 (I)（每組n = 5），每?幅圖像以相同的放大倍數(shù)拍攝。J、K分別代表各組（?每組n = 5）肝臟 ( J ) 和血清 ( K ) 中的甘油三酯 ( TG ) 水平。L - N為 LipidTox 染色代表性圖片 ( L )，以及從Gap fl和Gap Alb分離的原代肝細胞中脂滴計數(shù) ( M ) 和平均面積 ( N ) 的定量結(jié)果。這些細胞在 HBSS 禁食 24 小時后，分別用 1 mM 絲氨酸處理或不處理 (每組n = 4、4、5)。( L ) 中的圖像均以相同的放大倍數(shù)拍攝。*P ?< 0.05，**P ?< 0.01；數(shù)據(jù)采用單因素方差分析 ( M、N ) 和雙因素方差分析進行分析。

進一步的解剖學結(jié)果顯示，在禁食16小時后，Gap fl小鼠補充絲氨酸或甘氨酸均導致肝臟呈紅色；而在禁食16小時后， Gap Alb小鼠補充絲氨酸（而非甘氨酸）可使肝臟體積縮小，肝臟顏色恢復正常，且肝臟與體重的比值降低（圖 5D、E）。PASH染色和肝糖原測定結(jié)果顯示，禁食的Gap fl和Gap Alb小鼠肝糖原耗竭，補充絲氨酸可輕微但顯著地提高Gap fl小鼠的肝糖原水平（圖 5F、G ）。此外，H&E染色、油紅O染色和甘油三酯（TG）測定結(jié)果顯示，兩種補充劑均可減少禁食的Gap fl小鼠的脂質(zhì)積累；而在禁食的Gap Alb小鼠中，補充絲氨酸（而非甘氨酸）可減少脂質(zhì)積累（圖 5H-J）。此外，雖然補充絲氨酸對禁食的Gap fl和Gap Alb小鼠的血清 TG 水平?jīng)]有影響，但甘氨酸顯著增加了禁食的Gap Alb小鼠的血清 TG 水平（圖 5K）。

本研究還利用原代肝細胞探討了絲氨酸對脂質(zhì)積累的影響。與Gap fl 小鼠的肝細胞相比，正常情況下Gap Alb小鼠原代肝細胞中的脂滴更大（補充圖 8）。體外禁食24小時后，Gap Alb 小鼠原代肝細胞中的脂滴體積和面積均大于Gap fl小鼠；而絲氨酸顯著降低了禁食后Gap Alb小鼠原代肝細胞中脂滴面積的增加（圖 5L-N）。

補充絲氨酸可降低禁食的Gap Alb小鼠肝臟中Lipin1的水平，從而減少DAG的合成，緩解肝臟脂質(zhì)積累。

為了分析絲氨酸如何降低禁食Gap Alb小鼠肝臟中的脂質(zhì)積累，我們對禁食16小時的Gap fl和Gap Alb小鼠（補充或不補充

絲氨酸）的肝臟進行了脂質(zhì)組學研究。主成分分析（PCA）顯示組內(nèi)重復性良好，組間區(qū)分度良好（圖 6A）。熱圖分析在不同組間鑒定出21種脂質(zhì)亞類（圖 6B）。與Gap fl小鼠相比，Gap Alb小鼠在禁食 16 小時后表現(xiàn)出 11 種差異性豐富的肝臟脂質(zhì)亞類，包括兩種顯著上調(diào)的亞類（二酰甘油 (DAG) 和 TG），以及九種顯著下調(diào)的亞類（磷脂酰絲氨酸 (PS)、磷脂酸 (PA)、溶血磷脂酰乙醇胺 (LPE)、溶血磷脂酸 (LPA)、溶血磷脂酰膽堿 (LPC)、磷脂酰膽堿 (PC)、烷基 PC (PC-O)、鞘磷脂 (SM) 和己糖基神經(jīng)酰胺 (HexCer)）（圖 6C和補充表 2）。在禁食的Gap Alb小鼠肝臟中，補充絲氨酸逆轉(zhuǎn)了禁食誘導的DAG和TG水平上調(diào)，以及PA、LPC和SM水平下調(diào)（圖 6C和補充表 2 ）。禁食的Gap Alb小鼠肝臟中，PA以及DAG和TG中的大多數(shù)脂質(zhì)種類均發(fā)生顯著變化，而補充絲氨酸可逆轉(zhuǎn)這些變化（圖 6D -F ）。在禁食的Gap Alb小鼠肝臟中顯著下調(diào)的9種SM中，SM(42:2, O2)、SM(38:1, O2)和SM(34:1, O2)的降低被補充絲氨酸逆轉(zhuǎn)；而在4種下調(diào)的LPC脂質(zhì)中，LPC(18:1)和LPC(16:0)的降低被補充絲氨酸逆轉(zhuǎn)（補充圖 9A、B）。然而，在禁食的Gap Alb小鼠中，只有肝臟Pla1a（磷脂酰絲氨酸特異性磷脂酶 A1）顯著降低，但絲氨酸補充并不能挽救所檢測的 LPC 和 SM 合成相關(guān)酶的 mRNA 水平（補充圖 9C）。

圖 6：絲氨酸補充劑通過抑制禁食的Gap Alb小鼠的 Lipin1 來減少肝臟二酰甘油的合成，從而緩解脂質(zhì)積累。

A.指定組別肝臟脂質(zhì)譜的PCA得分圖。B .禁食16小時后，補充或不補充絲氨酸的Gap fl和Gap Alb小鼠肝臟中總脂質(zhì)亞類的脂質(zhì)組學分析熱圖（?每組n =4）。C .指定組別差異脂質(zhì)亞類的火山圖。D - F.指定組別中PA（ D）、DAG（E）和TG（F）亞類的脂質(zhì)組學分析詳細信息。G . RNA-seq揭示的TG合成相關(guān)基因的熱圖。H .指定組別肝臟中Lipin1和Lipin2的mRNA水平（?每組n =4）。I .指定組別肝臟中Lipin1和Lipin2的蛋白水平（?每組n =3）。CT- Gap fl，正常飲水的Gap fl小鼠；CT- Gap Alb，正常飲水的Gap Alb小鼠。 Ser- Gap Alb：飲用水中添加5%絲氨酸的Gap Alb小鼠；Gly- Gap Alb：飲用水中添加5%甘氨酸的Gap Alb小鼠。 *P ?< 0.05，**P ?< 0.01；數(shù)據(jù)采用單因素方差分析進行分析。

由于PA、DAG和TG是TG合成過程中連續(xù)的代謝中間體（圖 6G），絲氨酸補充后肝臟PA水平升高而DAG和TG水平降低，提示PA-DAG合成下調(diào)或DAG-PA分解代謝促進可能是絲氨酸治療的禁食Gap Alb小鼠肝臟TG水平降低的原因。我們進一步利用RNA測序數(shù)據(jù)特異性地富集了TG合成通路（圖 6G ）。與Gap fl小鼠相比，禁食Gap Alb小鼠肝臟中催化PA合成DAG的關(guān)鍵酶Lipin1和Lipin2表達上調(diào)；而絲氨酸治療逆轉(zhuǎn)了這些變化（圖 6G ）。qPCR檢測證實了RNA測序結(jié)果中觀察到的變化；結(jié)果顯示，禁食Gap Alb小鼠中僅Lipin1蛋白水平顯著升高，而絲氨酸治療后則降低（圖 6H、I）。

在Gap Alb小鼠肝臟中過表達 hGAPDH可挽救禁食引起的肝腫大和脂質(zhì)蓄積。

為了驗證GAPDH在禁食誘導的肝腫大和脂質(zhì)蓄積中的作用，我們通過靜脈注射腺相關(guān)病毒（AAV）包裝的人GAPDH，在Gap Alb小鼠（hGAP-rescue小鼠）中過表達肝臟GAPDH。AAV注射后4周，GAPDH表達成功（補充圖 10A）。與Gap Alb小鼠相比，hGAP-rescue小鼠的體重和血糖水平相似，但解剖分析表明，禁食16小時后，hGAP-rescue小鼠的肝臟體積縮小，顏色呈正常的紅色（補充圖 10B-D）。與此一致的是，禁食16小時后，與Gap Alb小鼠相比，hGAP-rescue小鼠的肝臟/體重比顯著降低，與Gap fl小鼠相似（補充圖 10E）。同時，與禁食的Gap Alb小鼠相比，組織學檢查顯示，禁食的hGAP拯救小鼠肝臟切片上的脂滴面積減少，肝臟和血清甘油三酯水平降低（補充圖 10F-I ）。此外，禁食引起的Gap Alb小鼠肝臟絲氨酸和甘氨酸水平下調(diào)在hGAP拯救后恢復正常（補充圖 10J、K ）。禁食的Gap Alb小鼠肝臟中Lipin1水平升高，hGAP拯救后也下調(diào)（補充圖 10L）。

敲除 Lipin1 可挽救禁食Gap Alb小鼠的肝腫大和脂質(zhì)積累。

為了驗證Lipin1是否在Gap Alb小鼠禁食誘導的脂質(zhì)積累中發(fā)揮關(guān)鍵作用，我們靜脈注射了攜帶靶向Lipin1的shRNA的腺相關(guān)病毒（AAV-shLipin1）。注射后4周， Gap Alb小鼠肝臟中Lipin1的mRNA和蛋白水平均顯著降低（圖 7A、B）。與對照組相比，AAV-shLipin1處理的Gap Alb小鼠在禁食16小時后，體重和血糖水平相似，但肝臟體積縮小，顏色仍呈正常的紅色（圖 7C-E）。與禁食的對照組小鼠相比，AAV-shLipin1處理的Gap Alb小鼠肝臟/體重比值顯著降低，脂滴面積和肝臟甘油三酯水平也顯著降低，但血清甘油三酯水平相似（圖 7F-I）。

圖 7：敲低Gap Alb小鼠肝臟中的 Lipin1可減輕禁食引起的肝腫大和脂質(zhì)積累。

A、B：注射對照AAV （AAV-shNC；shNC- Gap fl或 shNC- Gap Alb）的Gap fl和Gap Alb小鼠，以及注射AAV-shLipin1（shLipin1-Gap Alb）的Gap Alb小鼠禁食16小時后，肝臟中Lipin1的mRNA（A）和蛋白（B）水平（mRNA和蛋白水平每組n=5或3）。C、D：shNC-Gap fl、shNC-Gap Alb和shLipin1 -Gap Alb小鼠禁食16小時后?的體重（BW ；C）和血糖水平（D ）（每組n = 5 ）?。E ：各組代表性肝臟解剖圖像。F ：各組禁食16小時后肝臟重量與體重的比值（?每組n =5）。圖G為代表性的H&E染色（左上）和油紅O染色（左下）圖像，以及各組（每組n ?=5）肝臟切片上每視野LD面積的定量結(jié)果（右）。每幅圖像均以相同放大倍數(shù)拍攝。圖H、I為shNC- Gap fl、shNC- Gap Alb和shLipin1- Gap Alb小鼠禁食16小時后的肝臟（H）和血清（I）TG水平（?每組n =5）。 *P ?<0.05，**P ?<0.01；數(shù)據(jù)采用單因素方差分析進行分析。

絲氨酸通過抑制生酮飲食喂養(yǎng)的Gap Alb小鼠肝臟中Lipin1的水平來減輕肝臟甘油三酯的積累。

生酮飲食（KD），包括長鏈甘油三酯生酮飲食（LCT-KD）和中鏈甘油三酯生酮飲食（MCT-KD），能夠模擬禁食的代謝[ 25 ]。我們研究了生酮飲食下肝臟Gapdh缺乏是否與禁食具有相似的影響。在生酮飲食喂養(yǎng)下，Gapdh主要在門靜脈區(qū)表達（補充圖 11A）。與Gap fl 小鼠相比，Gap Alb小鼠在MCT/LCT-KD喂養(yǎng)3天后體重減輕（補充圖 11B、C）。與長期禁食類似，MCT-KD喂養(yǎng)的Gap Alb小鼠和Gap fl小鼠的血糖水平相當（補充圖 11D）。解剖學結(jié)果顯示，MCT/LCT-KD喂養(yǎng)的Gap Alb小鼠肝臟顯著增大且顏色變淺，肝臟與體重的比值增加（補充圖 11E-H ）。同時，H&E染色和油紅O染色顯示Gap Alb小鼠肝臟中脂質(zhì)積累更多，而PASH染色顯示兩個MCT-KD喂養(yǎng)組的肝糖原均已耗竭（補充圖 11I ）。與Gap fl小鼠相比，MCT/LCT-KD喂養(yǎng)的 Gap Alb小鼠肝臟甘油三酯（TG）水平升高，但血清TG水平未見升高（補充圖11J-N ）。由于生酮飲食喂養(yǎng)下的表型與Gap Alb小鼠高度相似，且MCT油比LCT油更具生酮作用且更易被接受[ 25 ]，因此在后續(xù)實驗中使用了MCT-KD。

為了研究禁食對Gap Alb小鼠的影響，我們檢測了KD喂養(yǎng)的Gap Alb小鼠肝臟中參與甘油三酯（TG）合成的基因的mRNA水平。與Gap fl小鼠相比， MCT-KD喂養(yǎng)的Gap Alb小鼠肝臟中Gpam、Gpat3、Lipin1、Lipin2和Dgat1的mRNA水平顯著升高（補充圖 12A ）。與此一致的是， Gap Alb小鼠肝臟中Gk和Lipin1的蛋白水平也高于Gap fl小鼠（補充圖 12B）。

禁食和生酮飲食喂養(yǎng)小鼠表型高度相似，這讓我們懷疑生酮飲食喂養(yǎng)的Gap Alb小鼠肝臟脂質(zhì)積累增加是否也與肝臟絲氨酸/甘氨酸水平改變有關(guān)。高效液相色譜分析顯示，與Gap fl小鼠相比，MCT-生酮飲食喂養(yǎng)的Gap Alb小鼠肝臟中絲氨酸和甘氨酸水平降低，但血清中未見降低（補充圖 12C、D）。此外，與Gap fl小鼠相比，MCT -KD喂養(yǎng)的 Gap Alb小鼠肝臟中，參與絲氨酸/甘氨酸攝取和合成的基因（如Slc38a1 / 4、Phgdh和Psat1）表達上調(diào)，而參與絲氨酸/甘氨酸降解和利用的基因（包括Agxt、Glyctk、Ptdss1、Amt、 Gcsh和Sardh）表達下調(diào)（補充圖 12E-H）。因此，與禁食類似，肝細胞Gapdh敲除導致肝臟絲氨酸水平降低和 Lipin1 水平升高，從而促進 KD 喂養(yǎng)后肝臟 TG 的積累。

我們進一步在飲用水中添加5%的絲氨酸， 用于喂養(yǎng)MCT-KD的Gap Alb小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清和肝臟絲氨酸水平顯著升高，肝臟甘氨酸水平略有升高（圖8A、B），但絲氨酸補充并未影響小鼠的體重減輕和體重（圖 8C、D）。與絲氨酸在空腹狀態(tài)下良好的促葡萄糖生成能力相一致，絲氨酸也輕微上調(diào)了喂養(yǎng)MCT-KD的Gap Alb小鼠的血糖水平（圖 8E ）。與空腹狀態(tài)下的結(jié)果一致，絲氨酸補充顯著減輕了喂養(yǎng)MCT-KD的Gap Alb小鼠的肝臟脂質(zhì)蓄積，并上調(diào)了Lipin1的表達（圖 8F-J）。

圖 8：絲氨酸通過抑制 MCT-KD 喂養(yǎng)的Gap Alb小鼠的 Lipin1 水平來緩解肝臟脂質(zhì)積累。

A、B：在MCT-KD喂養(yǎng)3天后，補充或不補充絲氨酸的Gap fl和Gap alb小鼠血清（A）和肝臟（B）中絲氨酸和甘氨酸的水平（?每組n =5）。C - E ：在MCT-KD喂養(yǎng)下，各組小鼠的體重（C）、體重變化（D）和血糖水平（E ）（?每組n =5）。F ：各組小鼠肝臟切片的代表性H&E染色（左上）和油紅O染色（左下）及其每視野脂滴面積的定量結(jié)果（右），每幅圖像均以相同放大倍數(shù)拍攝。G 、H：各組小鼠肝臟（G）和血清（H）中甘油三酯（TG）的水平（每組n ?=5）。I ：各組小鼠肝臟中脂蛋白1（ Lipin1）的mRNA水平（?每組n =5）。 J. MCT-KD喂養(yǎng)下各組肝臟中Lipin1和Lipin2的蛋白水平（?每組n =3）。 *P ?<0.05，**P ?<0.01；數(shù)據(jù)采用單因素方差分析進行分析。K .示意圖總結(jié)。在肝細胞中，GAPDH在禁食和MCT-KD喂養(yǎng)下維持丙酮酸衍生糖異生、絲氨酸合成和甘油三酯（TG）合成之間的平衡。而在GAPDH缺陷的肝細胞中，丙酮酸衍生糖異生受阻，甘油糖異生在禁食時主導血糖穩(wěn)態(tài)；營養(yǎng)限制導致絲氨酸合成受損，Lipin1升高，進而導致二酰甘油（DAG）和TG進一步積累。

【貢獻】★★★★★

總之，我們發(fā)現(xiàn)GAPDH在禁食期間肝臟葡萄糖-脂質(zhì)-氨基酸代謝中起著核心作用，它調(diào)節(jié)糖異生底物（丙酮酸與甘油）的偏好，從而維持血糖穩(wěn)定并控制絲氨酸依賴的脂質(zhì)代謝。這些發(fā)現(xiàn)還表明，補充絲氨酸可以作為一種策略，以減輕禁食干預相關(guān)的代謝并發(fā)癥。

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