放苗密度多少為佳？這此終于有答案了！

凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)生長速度快、耐鹽范圍廣、抗病力強，其產量約占全球對蝦產量的70%。自1987年引入我國以來，凡納濱對蝦迅速成為我國主要的對蝦養殖品種之一，養殖產量占全球總產量的 21%(黃志堅等, 2016)。目前，凡納濱對蝦養殖模式主要有池塘養殖、高位池養殖和工廠化養殖(岑伯明, 2010; 王峰等, 2013; 高欣等, 2017; 沈明明等, 2017)。池塘和高位池養殖模式存在水資源浪費嚴重、單位水體對蝦產量低、病毒性疾病頻發、污染周圍水體等缺點(董雙林等, 2000; 曲克明等, 2000)；而工廠化養殖具有換水量少、養殖密度高、可避免病原微生物侵襲等優點(吳晨等, 2011)。因此，我國對蝦工廠化養殖規模呈逐年增加的趨勢。

在工廠化養殖中，為提高對蝦飼料利用率和促進對蝦快速生長，通常需要對蝦苗種進行中間培育，即對體長為0.3~0.5cm的凡納濱對蝦蝦苗進行集中飼養管理，使其快速生長至1~2cm仔蝦的養殖過程。在對蝦苗種中間培育期間，放養密度、水質、水體細菌數量及菌落組成的控制通常是決定對蝦苗種中間培育成敗的關鍵。放養密度過高會導致水質惡化，加速細菌快速生長繁殖，改變水體中微生物群落結構，進而影響養殖對蝦的患病概率和發病速度(丁美麗等,1997;陳琛等,2016;Apún-Molina et al, 2017)。同時，放養密度還會對凡納濱對蝦的生理行為、免疫指標和能量轉化等產生重要影響，進而改變其生長速度和養殖產量(李純厚等, 2006; 李玉全等, 2007; 張天時等,2008; 衣萌萌等, 2012)。

目前，關于放養密度對凡納濱對蝦苗種中間培育效果的研究較為有限。本研究通過凡納濱對蝦養殖場實際苗種中間培育實驗，探究了放養密度對凡納濱對蝦生長性能、主要水質指標及微生物群落結構的影響，以期為凡納濱對蝦工廠化養殖提供生產性技術指導。

1 材料和方法

1.1 實驗設施

本研究選取12個有效容積為25m3的水泥池(5m，5m，1m)作為凡納濱對蝦苗種中間培育池，池底均勻布設 100個氣石，采用空氣增氧；養殖用水為經砂濾、消毒后的地下海水，鹽度為31；每個池體上方棚頂設置 1個采光口(3m，1 m)，光照控制在1000~1500 lx。實驗所用凡納濱對蝦苗種由青島卓越海洋集團有限公司培育，每尾平均體重為(6.0±0.5)mg。

1.2 實驗設計

鑒于養殖場凡納濱對蝦苗種中間培育實際放養密度一般為 1.50萬尾/m3，本研究設置 4 個實驗組，放養密度分別為1.5萬尾/m3(P1 組)、1.75萬尾/m3 (P2組)、2.0萬尾/m3 (P3組)和2.25萬尾/m3(P4組)，每個實驗組設3個平行。實驗共進行21d。實驗前期(1~7 d)，每天投喂3次鹵蟲(Brine shrimp)無節幼體(粗蛋白含量為 57%)，投喂時間為08:00、16:00和24:00；投喂蝦片(粗蛋白含量為48%)6次，投喂時間為06:00、09:00、12:00、15:00、18:00 和 21:00，鹵蟲無節幼體和蝦片日投喂總量為對蝦總重的10%；實驗中期(8~13 d)，混合投喂蝦片和對蝦商品配合飼料(粗蛋白含量為42%)，蝦片所占比例由75%逐漸降到25%，日投喂總量為對蝦總重的8%，投喂次數和時間與實驗前期相同；實驗后期(14~21d)，投喂對蝦商品配合飼料，日投喂量由對蝦總重的8%逐漸降到6%，投喂次數和時間同實驗前期。并每天向各個池體潑灑光合細菌和乳酸多肽，使養殖池內二者濃度分別達到50、20mg/L。

實驗初始，養殖池水位為0.6m，前3d為蝦苗適應期，不換水；從第3天開始, 每天補水0.1m，補至0.9m，補水時間為 08:30；從第7天開始，每天換水1次，日換水量由養殖池內高度增加0.05m，逐漸遞增至 0.30m，換水時間與補水時間相同。在補、換水時，要保持較小的流量，以避免對蝦苗種產生應激反應，同時，各個養殖池內補、換水量相同。實驗過程中，各養殖池內水體溫度、鹽度、溶解氧分別保持在 28~30℃、31~32、5.8~6.0mg/L。每天08:00采集水樣，測定各個養殖池內氨氮(NH4+-N)和亞硝酸氮(NO2-N)濃度以及弧菌(Vibrio)濃度；每3d測定1次水體的化學需氧量(COD)，與上述測定指標采用同一批水樣。實驗結束后，各池內隨機抽取50尾對蝦，對其生物學體長和體重進行測量，并計算平均值；同時, 檢測各個養殖池內養殖水體的微生物群落。

1.3 分析方法

1.3.1 對蝦生長性能

實驗結束后，排干養殖池水并收獲對蝦。分別使用游標卡尺和電子天平測量各養

殖池內凡納濱對蝦的生物學體長和體重，并分別計算對蝦的產率、特定增長率、存活率以及餌料轉化率，

公式如下：

產率(Yield rate,YR)= (收獲對蝦總重量－放苗對蝦總重量)/放苗對蝦總重量

特定生長率(Specific growth rate, SGR, %/d)=[ln(對蝦收獲體重)－ln(對蝦初始體重)]×100/(實驗天數)

存活率(Survival rate, SR, %)= 對蝦收獲數量/對蝦放苗數量×100

餌料轉化率(Feed conversion rate, FCR, %)= 飼料利用干重/對蝦收獲增重×100

1.3.2 常規水質指標

利用水質YSI 556檢測儀(美國)監測水體溫度、溶解氧、pH 和鹽度。NH4+-N、NO2-N和COD濃度分別采用采用靛酚藍分光光度法、鹽酸萘乙二胺分光光度法和堿性高錳酸鉀法測定。弧菌濃度采用涂布平板的方法測定，將0.1ml水樣使用涂物棒均勻涂布在TCBS培養基上，24h后觀測和記錄培養基上菌落數量。

1.3.3 微生物群落

實驗結束后，使用1L的滅菌聚乙烯瓶采集水樣，將水樣放置搖床，于300r/min搖晃10min后，用0.22μm 孔徑無菌濾膜抽濾。抽濾膜使用細菌基因組 DNA 提取試劑盒提取水樣DNA，利用帶有 Barcode 的特異性引物(515F和806R)對提取的水樣基因組DNA的16SV4區進行PCR擴增。在PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測后，使用TruSeq? DNA PCR–Free Sample Preparation Kit 建庫試劑盒進行文庫構建。若文庫合格，使用 HiSeq 2500PE250 進行上機測序。

下機數據在截取 Barcode 和引物序列后，使用FLASH 1.2.7軟件對樣品Reads進行拼接，得到原始數據(Raw Tags)(Mago? et al, 2011)；利用Qiime 1.9.1軟件對 Raw Tags 進行過濾處理，得到高質量 Tags 數據(Clean Tags)(Caporaso et al, 2010; Bokulich et al,2013)；Clean Tags 序列通過(UCHIME Algorithm)與數據庫(Gold database)進行比對(Edgar et al, 2011)，去除其中的嵌合體序列(Hass et al, 2011)，得到有效數據(Effective Tags)。使用 Uparse v7.0.1001 軟件將所有Effective Tags聚類(97%)成為操作分類單元(Operational Taxonomic Units，OTUs) (Edgar, 2013)；通過Mothur方法與SILVA的SSUrRNA數據庫OTUs對比進行物種注釋(Wang et al, 2007; Quastet al, 2013)。通過香農指數(Shannon index)確定水樣細菌生物多樣性。使用 Origin.8 軟件對水樣細菌相對豐度(門和屬)進行制圖。

1.3.4 數據處理

采用SPPS軟件對實驗數據進行統計分析、差異顯著性檢驗分析，用t檢驗計算P值，P<0.05時，為差異顯著，P<0.01 時，為差異極顯著。

2 結果

2.1 密度對凡納濱對蝦生長性能的影響

不同放養密度對凡納濱對蝦生長性能的影響見表1。從表1可以看出，實驗結束后，各養殖池蝦苗的平均體重增加了9.3~10.5 倍。在放養密度為1.50~2.25 萬尾/m3條件下，凡納濱對蝦YR、SGR、SR 以及FCR均隨著放養密度的增加而逐漸升高。

2.2 放養密度對水質的影響

2.2.1 pH

不同放養密度養殖池中水體pH隨實驗的進行整體呈現下降的趨勢(圖 1)。實驗期內，各組pH由8.00分別降低至7.72、7.66、7.67 和 7.59，而實驗后期，換水量的增加能有效抑制pH的下降。P1、P2、P4 組間水體的 pH 存在顯著差異(P<0.05)，而 P2、P4組水體pH較為接近。總體而言，水體pH隨著放養密度的增加而降低。

2.2.2 氨氮和亞硝酸氮濃度

隨著凡納濱對蝦苗種中間培育實驗的進行，各實驗組水體NH4+-N濃度均呈逐漸上升趨勢(圖2)。實驗結束時，各密度組水體NH4+-N 濃度分別達到 3.53、4.23、4.88和5.55mg/L。水體NH4+-N 濃度隨著對蝦放養密度的增加而升高，且不同放養密度組間差異顯著(P<0.05)。NO2-N濃度在實驗前期(1~7d)變化緩慢，在實驗中后期(8~21d)快速上升。實驗結束時，各密度組水體NO2-N濃度分別達到 0.20、0.24、0.21和0.02 mg/L，但不同放養密度組間NO2-N 濃度差異并不顯著(P>0.05)。

2.2.3 COD濃度

實驗前、中期(1~13d)，水體COD 濃度呈上升趨勢；實驗后期(14~21d)，隨著換水量的增加，水體COD濃度呈現下降的趨勢(圖3)。實驗結束時，各密度組水體 COD 濃度分別達到6.4、7.2、7.6 和 7.8 mg/L。COD 濃度隨放養密度的增加而有所增加，且不同密度組間差異顯著(P<0.05)。

2.2.4 水體弧菌濃度

實驗前、中期，水體中弧菌濃度保持相對穩定，為(0.3~3.0)×104 CFU/ml；實驗后期，受日換水量增加的影響，各實驗組水體弧菌濃度存在一定程度的波動，其中，P4組波動最大(圖4)。實驗結束時，各實驗組水體弧菌濃度分別為 2.3×1041.8× 104、3.8×104 和 4.3×104 CFU/ml，弧菌濃度與養殖密度不存在相關性。

2.3 放養密度對水體微生物群落結構的影響

2.3.1 細菌生物多樣性

香農指數在一定程度上可以反映水體中細菌的生物多樣性，通常香農指數越大，說明其生物多樣性越高(Cardona et al, 2016)。從圖5可以看出，各實驗組間香農指數存在顯著性差異(P<0.05)，其中，P1、P2 組存在極顯著差異(P<0.01)，P2 組香農指數明顯高于其他各組。總體而言，香農指數隨養殖密度的升高呈現上升的趨勢。

2.3.2 水體中細菌優勢種群

不同放養密度養殖池內細菌群落的主要組成見表2。從表2可以看出，變形菌門(Proteobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)為各組水體的主要細菌門類。α- 變形菌綱(Alphaproteobacteria)紅桿菌科(Rhodobacteraceae)和γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)弧菌科(Vibrio)在變形菌門中分別占 46%~81%和 2%~23%。黃桿菌綱(Flavobacteriales)黃桿菌科(Flavobacteriales)、鞘氨醇桿菌綱(Sphingobacteriales)腐螺旋菌科(Saprospiraceae)和噬纖維菌綱(Cytophagales)Algorriphogus 菌科分別占擬桿菌門的 3%~13%、21%~44%和8%~62%。

實驗結束時，各實驗組水體主要菌屬的相對豐度見圖6。從圖6可以看出，P1組Algorriphogus的相對豐度最高(13.5%)，弧菌屬次之(5.1%)；P2和P4組弧菌屬的相對豐度最高(9.4%、8.1%)，棲東海菌屬(Donghicola)次之(5.3%、8.0%)；P3 組弧菌屬相對豐度最高(2.3%)，海命菌屬(Marivita)次之(1.8%)。弧菌屬在不同放養密度養殖池水體中均為優勢菌屬。

3 討論

3.1 放養密度對凡納濱對蝦生長性能的影響

SR及SGR是影響凡納濱對蝦YR的直接因素。因此，本研究以對蝦YR來衡量凡納濱對蝦苗種中間培育效果。結果顯示，在放養密度為1.5~2.25萬尾/m3條件下，隨著放養密度的增加，凡納濱對蝦SR、SGR及YR均逐漸升高。這與李純厚等(2006)、李玉全等(2007)、衣萌萌等(2012)研究結果相悖，這主要是由于對蝦苗種中間培育階段對蝦規格小、密度低，同時，因密度脅迫所產生的空間擁擠效應并不明顯(Ngaet al, 2005)。

本研究結果顯示，當放養密度為1.5~2.25萬尾/m3時，適當提高養殖密度有利于提升凡納濱對蝦苗種中間培育效果。其主要原因在于本研究設定的放養密度范圍內，當放養密度較高時，單位水體餌料投喂量較大，有利于對蝦對餌料的攝取。因此，在凡納濱對蝦苗種中間培育實際工廠化養殖中，也可以將對蝦苗種中間培育實際放養密度由1.5 萬尾/m3增加至2.25萬尾/m3，以提高養殖對蝦產量和增加養殖效益。

3.2 放養密度對養殖水體水質的影響

養殖水體水質受餌料投喂、凡納濱對蝦生理活動(攝食、排泄、呼吸代謝等)以及水體微生物代謝的影響(劉嬌等, 2008)。在對蝦苗種中間培育過程中，對蝦及微生物呼吸代謝產生的CO2積累，導致水體pH逐漸下降。放養密度和微生物豐度越高，水體pH下降越快。餌料是水體有機物負荷的主要來源，隨著對蝦養殖個體的增大和養殖密度的加大，飼喂量逐步提高，從而導致水體 COD 濃度的上升。餌料中蛋白質含量較高則是導致水體中NH4+-N和NO2-N 濃度升高的主要原因。在對蝦苗種中間培育期間，隨著對蝦養殖個體的增大和養殖密度的加大，餌料投喂量進一步加大，從而導致水體NH4+-N和NO2-N濃度的上升。本研究表明，放養密度較大的養殖池內水體pH較低，而NH4+-N 和 COD 濃度較高，與丁美麗等(1997)研究的結果相吻合。

為避免水質惡化，換水是調節水質指標的有效措施，也是養殖企業最常用的方法。實驗期間，隨著凡納濱對蝦養殖個體的增大和養殖密度的加大而逐步提升換水量，最大換水量占總水體的33%，在一定程度上抑制水體pH的下降和COD濃度的升高，但對調節NH4+-N和NO2-N 濃度作用有限。實驗結束時，NH4+-N 濃度達到 3.53~5.80mg/L，超出了姚慶禎等(2002)研究的對蝦養殖安全濃度(0.79 mg/L)，但是，實驗過程中，尚未發現該濃度對凡納濱對蝦苗種生長和SR構成影響。

結果顯示，在本研究條件下，換水對養殖水體水質的調節能力有限。然而，增大換水量在增加生產成本的同時，也可能造成凡納濱對蝦產生應激反應，對其生長存活產生負面影響，因此，需要引入更加高效的對蝦養殖模式(如生物絮團養殖、循環水養殖)為凡納濱對蝦養殖提供穩定的水質保證(張許光等, 2013)。

在對蝦養殖過程中，弧菌往往作為致病菌或者條件致病菌存在，因而成為養殖水體檢測的重要微生物指標(張彬等, 2015; 黃志堅等, 2016)。本研究表明，對蝦放養密度與水體弧菌濃度無顯著相關，這與 Cao等(2013)的研究結果較吻合。實驗后期，各實驗組水體的弧菌濃度波動較大，這可能是由實驗后期換水量較大所致。整個實驗過程中，各養殖池水體弧菌濃度始終處在安全濃度以內(1.0×107 CFU/ml) (Gullian et al, 2004)。但是，弧菌濃度超標依然是工廠化養殖中對蝦死亡的重要原因之一，其致病機理和安全濃度值得進一步研究。

3.3 放養密度對水體細菌多樣性和群落結構的影響

養殖水體細菌生物多樣性和菌落結構受養殖生物種類、數量以及水體、水質等因素的影響。本研究結果表明，隨放養密度的增大，養殖水體中細菌生物多樣性總體上呈現上升趨勢。這是因為放養密度較高時，水體中COD、NH4+-N 和 NO2-N 濃度較高，為多種類型細菌的生長繁殖提供了較豐富的C源和N源(王以堯等, 2011; 陳琛等, 2016)。對蝦放養密度不僅會影響養殖水體中細菌生物多樣性，還會改變細菌的群落結構。本研究結果顯示，在水體細菌屬水平上，P1組內相對豐度最大的菌屬為Algorriphogus屬，而P2、P3、P4 組為弧菌屬；P1~P4 組內相對豐度處在第2位的菌屬分別為弧菌屬、棲東海菌屬、海命菌屬和棲東海菌屬。

養殖水體中，細菌生物多樣性和菌落結構對凡納濱對蝦內部細菌的生長具有重要影響，并在對蝦的營養利用、提高免疫力等方面發揮著重要作用(Luo et al,2006; 李玉宏等, 2014)。在放養密度較高的養殖池水體中，細菌生物多樣性也較高，這可以提高養殖系統的穩定性，降低致病菌或條件致病菌成為優勢菌群的可能性，從而可能在一定程度上降低凡納濱對蝦的發病率。而且，良好的菌落組成可以降低水體有機物負荷，改善對蝦腸道環境，從而提高對蝦的免疫力和抗病力(Apún-Molina et al, 2017)。

4 結論

在凡納濱對蝦苗種中間培育期間，放養密度(1.5~2.25萬尾/m3)的增加提高了凡納濱對蝦的生長性能(產率、特定生長率、存活率及餌料轉化率)。

隨著放養密度的增加，養殖水體pH有所降低，而COD和NH4+-N 濃度呈現上升的趨勢。換水量較大時，稀釋作用可以在一定程度上抑制養殖水體pH的下降及COD濃度的升高，但難以有效控制NH4+-N和NO2-N濃度的升高。

在凡納濱對蝦苗種中間培育期間，放養密度提高能有效提升養殖池內的細菌生物多樣性；養殖池內主要的細菌門類為變形菌門和擬桿菌門，弧菌為養殖水體中的優勢菌屬。

來源 | 漁業科學進展 作者：張龍,陳 釗,汪魯,陳世波,張 鵬,曲克明,李秋芬,朱建新

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